陳柏安，劉東超,2，王思盼

(1.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江 524088；2.廣東省藻類養(yǎng)殖及應(yīng)用工程技術(shù)中心，廣東 湛江 524025)

大型海藻具有效吸收水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水中大量氮、磷等營養(yǎng)鹽的功能，學(xué)界將其作為生物濾器開展了養(yǎng)殖水環(huán)境的生物修復(fù)研究，取得較好效果[1]。不同種類的大型海藻對(duì)水中溶解氮的生物過濾效果不同[2]。海藻對(duì)氮源的吸收還受環(huán)境參數(shù)(光、鹽度、溫度、干燥和水運(yùn)動(dòng))，海藻生物學(xué)特性、組織營養(yǎng)史、營養(yǎng)物質(zhì)濃度及化學(xué)形態(tài)等因素的影響[3-5]。鹽度是影響藻類生長和分布的重要環(huán)境因子之一[6-7]，但僅見少量有關(guān)鹽度對(duì)大型海藻吸收氮營養(yǎng)鹽影響的研究，未見關(guān)于不同鹽度條件下大型海藻氮營養(yǎng)鹽吸收動(dòng)力學(xué)的報(bào)道。

長莖葡萄蕨藻（Caulerpa lentillifera）是一種生長速度快、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高的可食用大型綠藻，其生存鹽度為20～50，在鹽度35 時(shí)生長速率最大，鹽度低于25 時(shí)光合作用受抑制[6]，鹽度對(duì)其生長發(fā)育有顯著影響[8]。在適宜NH4-N、NO3-N 比例的條件下，長莖葡萄蕨藻對(duì)NO3-N 有顯著的吸收和同化能力，有望有效控制水體硝酸氮濃度并將硝酸氮轉(zhuǎn)移到生物體中[9]。長莖葡萄蕨藻與魚蝦混養(yǎng)，對(duì)養(yǎng)殖水環(huán)境有顯著改善作用[10,11]。但該藻的氮營養(yǎng)生理學(xué)過程尚不明確，尤其是在不同鹽度和高濃度氮營養(yǎng)鹽條件下，該藻對(duì)不同化學(xué)形態(tài)氮鹽的吸收規(guī)律研究尚少。本研究分析在不同鹽度下長莖葡萄蕨藻對(duì)氨氮和硝態(tài)氮的吸收動(dòng)力學(xué)特征，為構(gòu)建以長莖葡萄蕨藻為生物濾器的水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

長莖葡萄蕨藻于2021 年4 月購自廣東省深圳市藍(lán)汀鼎執(zhí)生物有限公司，藻體用消毒海水沖洗，清除藻體上的附生生物及雜物，于室內(nèi)盛有消毒海水的塑料箱中暫養(yǎng)7 d，培養(yǎng)條件為溫度（22±1）℃，照度（2 000±100）lx，光/暗周期12 h L/12 h D，營養(yǎng)鹽為0.5 mmol/L 的NaNO3溶液和0.1 mmol/L 的KH2PO4溶液，海水鹽度30±1。實(shí)驗(yàn)前，選擇健壯、完整的長莖葡萄蕨藻藻體，仔細(xì)去除表面附著物后進(jìn)行48 h的氮饑餓處理[12]。實(shí)驗(yàn)用海水取自湛江霞山近岸海域，其本底氨氮質(zhì)量濃度為0.04 mg/L，硝酸氮質(zhì)量濃度為0.03 mg/L，活性磷質(zhì)量濃度為0.02 mg/L，pH為8.06。海水經(jīng)濾袋過濾、消毒后，使用海藻吸收水體營養(yǎng)鹽12 h，儲(chǔ)存在水桶中備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)容器為2 L 的塑料桶，每桶加入2 L 實(shí)驗(yàn)海水，各放入（10±1）g的處于N 饑餓狀態(tài)的新鮮長莖葡萄蕨藻。根據(jù)王海陽等研究[13]及本研究預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，長莖葡萄蕨藻在鹽度高于35 或低于25 時(shí)生長受抑制并出現(xiàn)部分藻體軟化現(xiàn)象，因此設(shè)置25、30和35 等3 個(gè)鹽度梯度，進(jìn)行NH4+-N 和NO3–-N 吸收實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)海水的鹽度為30，用蒸餾水或自然海鹽調(diào)節(jié)鹽度。將單一氮源的NH4+-N（NH4Cl）或NO3–-N（NaNO3）分別添加入實(shí)驗(yàn)海水中。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，NH4+-N 和NO3–-N 均按終末質(zhì)量濃度設(shè)置0、2、4、6、8、10、12 mg/L 等7 個(gè)梯度，每個(gè)梯度設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。實(shí)驗(yàn)海水中加入KH2PO4作為磷源，海水磷濃度達(dá)到4 mg/L，使海藻不會(huì)因缺磷而影響氮吸收[14]。各處理組均在光照培藻架上培養(yǎng)，照度為3 000 lx，溫度為（22±1）℃。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在0、1、2、3 h時(shí)測(cè)定海水氮營養(yǎng)鹽含量，用海水中的氮營養(yǎng)鹽下降量換算出氮營養(yǎng)鹽的吸收速率。實(shí)驗(yàn)用藥品均為國產(chǎn)分析純。

1.3 數(shù)據(jù)分析

長莖葡萄蕨藻吸收氮鹽速率(v)計(jì)算：

式中，Nt為培養(yǎng)th時(shí)水體的營養(yǎng)鹽濃度，V為取樣前水體的體積，m為實(shí)驗(yàn)開始時(shí)藻體的鮮質(zhì)量。

NH4-N 使用SmartChem 200 全自動(dòng)間斷化學(xué)分析儀測(cè)定，NO3-N用鋅鎘還原-重氮偶氮法測(cè)定[15]。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)表示，采用Graphpad Prism 7進(jìn)行非線性回歸擬合并作圖，最大吸收速率（vmax）和米氏常數(shù)（Km）用米氏動(dòng)力學(xué)方程擬合求得。使用如下公式計(jì)算米氏動(dòng)力學(xué)方程[16]：

式中，v為吸收速率（μg·g-1·h-1），vmax為最大吸收速率（μg·g-1·h-1），ρs為介質(zhì)中營養(yǎng)鹽質(zhì)量濃度（μg/L），Km為半飽和常數(shù)（μg/L）。

用軟件SPSS 24 分析相同營養(yǎng)鹽形式下長莖葡萄蕨藻在不同鹽度下吸收動(dòng)力學(xué)參數(shù)的差異以及相同營養(yǎng)鹽濃度下藻株不同氮源吸收速率的差異，若差異顯著則進(jìn)行Duncan’s多重比較。顯著水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 鹽度對(duì)長莖葡萄蕨藻硝態(tài)氮吸收的影響

圖1顯示，不同時(shí)間段的吸收曲線略有差異，但總的變化趨勢(shì)相似。在不同鹽度下，長莖葡萄蕨藻對(duì)NO3–-N 的吸收速率均隨培養(yǎng)介質(zhì)中硝態(tài)氮濃度的增加總體上呈增加趨勢(shì)。表1 可見，隨著時(shí)間的增加，硝酸氮最大吸收速率（vmax）總體上呈下降趨勢(shì)，鹽度25、35 時(shí)，1 h 的硝酸氮最大吸收速率（vmax)顯著高于2、3 h（P<0.05），鹽度30 組1、2、3 h 的vmax分 別 為 (179.8±17.4)、(141.10±13.82)、(150.7±24.1)μg/(g·h)，平均值分別高于其他鹽度組，但差異不顯著（P>0.05）。在相同時(shí)段，鹽度對(duì)長莖葡萄蕨藻硝態(tài)氮吸收速率的影響不顯著（P>0.05）。長莖葡萄蕨藻在1 h 時(shí)，硝態(tài)氮濃度在4 mg/L 時(shí)吸收速率便趨于平緩，而在3 h 時(shí)，硝態(tài)氮濃度達(dá)到6～8 mg/L時(shí)，吸收速率才趨于平緩。

圖1 不同鹽度下長莖葡萄蕨藻硝態(tài)氮的吸收曲線Fig.1 Absorption curve for nitrate nitrogen in Caulerpa lentillifera at different salinities

2.2 鹽度對(duì)長莖葡萄蕨藻氨氮吸收的影響

圖2 顯示，在不同鹽度下，長莖葡萄蕨藻對(duì)NH4+-N 的吸收速率均隨培養(yǎng)介質(zhì)中氨氮濃度的增加總體上呈上升趨勢(shì)。表1可見，在低鹽度下，長莖葡萄蕨藻對(duì)氨氮最大吸收速率較高，鹽度25 時(shí)，vmax為(435.2±57.2) μg/(g·h)，顯著高于鹽度35 時(shí)（P<0.05）。在高氮濃度下（12 mg/L），低鹽度組氨氮吸收速率相對(duì)于鹽度35 組有增加趨勢(shì)，培養(yǎng)1、2 h 時(shí)顯著高于鹽度35組（P<0.05）（圖2）。在各鹽度組，1 h的氨氮最大吸收速率顯著高于3 h（P<0.05），2 h時(shí)，鹽度25與鹽度30最大吸收速率無顯著差異（P>0.05），鹽度35 組顯著低于其他兩組（P<0.05）。在3 h時(shí)，各鹽度組長莖葡萄蕨藻的最大氨氮速率無顯著差異（P>0.05）。

表1 長莖葡萄蕨藻不同鹽度的氮鹽吸收動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較Table 1 Nitrogen uptake kinetics parameters of Caulerpa lentillifera at different salinities

圖2 不同鹽度下長莖葡萄蕨藻氨氮的吸收曲線Fig.2 Absorption curve for ammonia nitrogen in Caulerpa lentillifera at different salinities

2.3 不同鹽度下長莖葡萄蕨藻對(duì)硝酸氮和氨氮吸收動(dòng)力學(xué)參數(shù)的比較

3 種鹽度下長莖葡萄蕨藻對(duì)NH4+-N 和NO3–-N的vmax和Km見表1。1 h 時(shí)，長莖葡萄蕨藻對(duì)氨氮與硝酸氮的vmax均呈現(xiàn)低鹽度>高鹽度趨勢(shì)，但大多數(shù)組別差異不明顯，僅在氨氮的vmax上低鹽度（25、30）顯著高于高鹽度組（35）。長莖葡萄蕨藻對(duì)硝酸氮吸收的半飽和常數(shù)總體上大于氨氮的半飽和常數(shù)，且在不同鹽度下，硝酸氮在不同時(shí)段的Km差異較大（P<0.05），而吸收時(shí)間和鹽度對(duì)長莖葡萄蕨藻氨氮吸收的半飽和常數(shù)無顯著影響（P>0.05）。

3 討論

3.1 鹽度對(duì)大型海藻吸收氮鹽的影響

鹽度影響植物細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓，進(jìn)而影響細(xì)胞水分及對(duì)N、P 的吸收。不同大型海藻中，鹽度對(duì)其吸收氮營養(yǎng)鹽的影響不盡相同。在冷水性海帶（Saccharina latissima）和掌狀海帶（Laminaria digi‐tata）對(duì)NO3–-N 吸收研究中，低鹽度（18）比高鹽度（34）分別增加47%和33%[17]。天然海水鹽度降低到一半時(shí)，齒緣墨角藻（Fucus serratus）對(duì)NO3–-N 的吸收增加40%，而墨角藻（Fucus vesiculosus）和掌狀海帶（L.digitata）則無顯著影響[18]。細(xì)基江蘺繁枝變種（Gracilaria tenuistipitatavar.liui）在較低鹽度下(10～30)對(duì)NH4+-N 的吸收速率大于高鹽度(40)[19]。本研究表明，在較高氮質(zhì)量濃度（12 mg/L）條件下，長莖葡萄蕨藻對(duì)NH4+-N 的吸收速率呈現(xiàn)為低鹽度（25）高于高鹽度（35），而鹽度對(duì)硝酸氮的吸收速率無顯著影響。在實(shí)際應(yīng)用中，長莖葡萄蕨藻生長海域鹽度多為35，本研究中該藻吸收氮鹽的最適鹽度略低于最適生長鹽度，這可能是因?yàn)樵诘望}度條件下，藻體可快速吸收營養(yǎng)物質(zhì)，用于生長和短期的滲透壓調(diào)節(jié)。Roleda 等[4]提出海水中高營養(yǎng)物濃度和低鹽度的交互作用可彌補(bǔ)低鹽度任何獨(dú)立負(fù)面影響的假設(shè)，本研究結(jié)果可為該假設(shè)提供一定佐證。

在實(shí)際生產(chǎn)中，養(yǎng)殖戶多利用原位海域養(yǎng)殖長莖葡萄蕨藻，陸基水體養(yǎng)殖一般采用室內(nèi)工廠化水池（箱）的養(yǎng)殖方式[20]。實(shí)際應(yīng)用時(shí)，可根據(jù)海水鹽度條件，單養(yǎng)長莖葡萄蕨藻或與適宜的水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物混養(yǎng)。本研究雖有鹽度25 下氨氮吸收速率較高的結(jié)論，但在鹽度30 的條件下，長莖葡萄蕨藻對(duì)氮鹽亦有較高的營養(yǎng)鹽吸收性能，因此，本研究結(jié)果可為長莖葡萄蕨藻原位海域養(yǎng)殖或陸基池塘養(yǎng)殖提供參考。

在鹽度31 條件下，針葉蕨藻（Caulerpa sertular‐ioides）氨氮最大吸收速率為4.15 μmoL/(g·h)[21]，而本研究中長莖葡萄蕨藻的氨氮最大吸收速率可達(dá)(31.09±4.11)μmol/(g·h)[435 μg/(g·h)]，表明相近鹽度下蕨藻屬不同物種對(duì)氨氮吸收能力存在差異。

3.2 長莖葡萄蕨藻對(duì)氮鹽的吸收動(dòng)力學(xué)特征

營養(yǎng)吸收動(dòng)力學(xué)是一種推斷吸收機(jī)制的有效方法，可確定海藻的營養(yǎng)鹽吸收速率與營養(yǎng)鹽濃度的關(guān)系[4]，以此評(píng)估海藻在綜合養(yǎng)殖系統(tǒng)中的應(yīng)用潛力。營養(yǎng)吸收動(dòng)力學(xué)研究聚焦于營養(yǎng)鹽吸收過程中的吸收機(jī)制，若僅僅為被動(dòng)擴(kuò)散，吸收速率直接與電化學(xué)勢(shì)梯度(即外界營養(yǎng)鹽濃度) 呈線性關(guān)系，而易化擴(kuò)散和主動(dòng)傳遞則隨外界營養(yǎng)鹽濃度的增加表現(xiàn)出膜載體的飽和現(xiàn)象[22]。

海藻對(duì)NO3–-N 的吸收是需能的主動(dòng)運(yùn)輸過程，在植物代謝過程中受基因高度調(diào)控[23]。邵魁雙等[24]報(bào)道，緣管滸苔（Enteromorpha linza）和羽藻（Bryopsis plumosa）對(duì)NO3–-N 的吸收方式為主動(dòng)運(yùn)輸。長莖葡萄蕨藻對(duì)NO3–-N 有較強(qiáng)的親和力[9]。本研究表明，不同鹽度下，長莖葡萄蕨藻對(duì)NO3–-N的吸收速率隨硝酸氮濃度的升高而升高，當(dāng)硝酸鹽達(dá)到一定濃度，吸收速率趨于穩(wěn)定，符合主動(dòng)運(yùn)輸?shù)娘柡臀談?dòng)力學(xué)規(guī)律。這與一般大型海藻對(duì)硝酸氮的吸收為飽和吸收動(dòng)力學(xué)特征的結(jié)論一致。

海藻對(duì)NH4+-N 的吸收速率隨時(shí)間和物種的不同而不同。海藻對(duì)氨氮的轉(zhuǎn)運(yùn)包含兩個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，即氨氮在濃度低時(shí)通過被動(dòng)擴(kuò)散進(jìn)入藻體細(xì)胞，以及通過藻體細(xì)胞上跨膜運(yùn)輸?shù)鞍字鲃?dòng)運(yùn)輸進(jìn)入藻細(xì)胞[25]。自然海水中氨氮濃度較低，海藻對(duì)NH4+-N 的吸收主要為主動(dòng)運(yùn)輸，但更多是主動(dòng)運(yùn)輸與被動(dòng)運(yùn)輸?shù)慕Y(jié)合[26]。部分大型海藻對(duì)氨氮的吸收速率隨著氨氮濃度和吸收表面積的增大呈線性增長，這表明部分海藻對(duì)氨氮的吸收屬于被動(dòng)吸收[27]。對(duì)于大型海藻對(duì)氨氮的吸收是否遵循飽和吸收動(dòng)力學(xué)，可能與海藻生長的地理位置、生理代謝活動(dòng)和種間差異有關(guān)[28]。Taylor 等[27]研究發(fā)現(xiàn)，新西蘭東北部的5 種海藻中，僅雞毛菜（Pterocladia capillacea）對(duì)氨氮吸收表現(xiàn)出飽和吸收動(dòng)力學(xué)特征，Xiphophora chondrophylla、石莼（Ulvasp.)、紫菜(Porphyrasp.) 和滸苔（Enteronlorphasp.）的氨氮吸收速率與氨氮濃度則呈線性關(guān)系，而其他地區(qū)的Neoagardhiella baileyi、Gracilaria foliifera等海藻對(duì)NH4+-N 吸收表現(xiàn)出飽和吸收動(dòng)力學(xué)的特征。本研究表明，長莖葡萄蕨藻對(duì)NH4+-N 吸收表現(xiàn)出飽和吸收動(dòng)力學(xué)特征，這可能是因?yàn)殚L莖葡萄蕨藻分枝上有較多囊狀小球，比表面積較高，使長莖葡萄蕨藻在低氨氮濃度下也能通過主動(dòng)運(yùn)輸而較快吸收氨氮，而當(dāng)胞內(nèi)氨水平較高時(shí)，同化的氨會(huì)對(duì)攝取行為產(chǎn)生負(fù)反饋[29]。針葉蕨藻（Caulerpa sertulari‐oides）對(duì)NH4+-N 吸收亦表現(xiàn)出飽和吸收動(dòng)力學(xué)特征[29]，與本研究結(jié)果一致，可能與兩者分布的地理位置相同有關(guān)。

3.3 不同鹽度下長莖葡萄蕨藻對(duì)兩種形式氮鹽的吸收利用

一般地，海藻主要利用硝態(tài)氮(NO3–-N)、氨氮(NH4+-N)和尿素等3種形式的氮。硝酸氮和氨氮是大型海藻最主要的氮源，氨氮比硝酸氮和亞硝酸氮更易吸收[30]。了解海藻對(duì)特定營養(yǎng)物的吸收模式和偏好是優(yōu)化綜合水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵。研究表明，與NO3–-N 相比，許多海藻更優(yōu)先吸收NH4+-N[23]，然而，也有部分海藻在自然環(huán)境中優(yōu)先吸收其他形態(tài)的氮源。Li 等[31]研究發(fā)現(xiàn)，中國黃海滸苔（Ulva prolifera）優(yōu)先利用海水中的硝酸氮，其次是氨氮。海藻對(duì)氨氮與硝態(tài)氮的偏好可能與營養(yǎng)鹽在海藻中的傳遞和同化方式有關(guān)。本研究表明，長莖葡萄蕨藻對(duì)氨氮的最大吸收速率和半飽和常數(shù)皆優(yōu)于硝態(tài)氮，說明長莖葡萄蕨藻會(huì)優(yōu)先吸收氨氮作為氮源，這與大多數(shù)海藻相似[32]，但也有研究表明長莖葡萄蕨藻在NH4+-N 與NO3–-N 共存時(shí)，更傾向于優(yōu)先選擇NO3–-N[9]，這可能與海藻的生長狀態(tài)和環(huán)境因子密切相關(guān)。硝酸氮的吸收和同化過程的耗能高于氨氮，氨氮進(jìn)入藻細(xì)胞后可直接被同化，而硝酸氮進(jìn)入后還需進(jìn)行一系列的耗能還原反應(yīng)方被利用[33]。進(jìn)一步了解氨氮和硝酸氮在海藻中的吸收規(guī)律，對(duì)估計(jì)海藻氮吸收和提高海藻生產(chǎn)力有著重要意義。

4 結(jié)論

長莖葡萄蕨藻在不同鹽度下對(duì)硝態(tài)氮和氨氮的吸收符合飽和吸收動(dòng)力學(xué)特征，其對(duì)氨氮、硝態(tài)氮的吸收速率隨著濃度的上升而逐步上升。長莖葡萄蕨藻對(duì)氨氮的最大吸收速率顯著高于硝態(tài)氮的最大吸收速率，是硝態(tài)氮的2.4 倍。不同鹽度（25～35）對(duì)長莖葡萄蕨藻硝態(tài)氮吸收無顯著影響，但對(duì)氨氮的吸收有顯著影響，在較低鹽度（25）下，氨氮的吸收速率較高。本研究明確長莖葡萄蕨藻對(duì)硝態(tài)氮和氨氮在不同鹽度下的吸收規(guī)律，可為長莖葡萄蕨藻作為水產(chǎn)養(yǎng)殖生物濾器，選擇適宜混養(yǎng)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物，構(gòu)建陸基綜合水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)提供理論依據(jù)。