張文彥，劉 芳，劉夢露，陳德喜，張 晶，時紅波，于海濱

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)包括肝脂肪變、炎癥、肝細(xì)胞損傷和纖維化，其進(jìn)展可發(fā)生非酒精性脂肪性肝炎 (non-alcoholic steatohepatitis，NASH)、肝硬化和肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)[1]。NAFLD還是導(dǎo)致代謝綜合征(MetS)、2型糖尿病(T2DM)、動脈硬化性心血管相關(guān)疾病，還是結(jié)直腸腫瘤等高發(fā)的原因[2]。外泌體(exosomes)是直徑為30～150 nm的天然脂質(zhì)膜封閉的囊泡，攜帶多種分子，包括脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸等[3,4]，主要參與細(xì)胞間信息傳遞和物質(zhì)運(yùn)輸[5]。有研究表明外泌體參與肝臟細(xì)胞炎癥反應(yīng)、脂質(zhì)變性和肝纖維化的發(fā)生[6,7]，因此外泌體及其攜帶的蛋白有望成為NAFLD監(jiān)測的重要工具。本研究采用串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽(tandem mass tag，TMT)標(biāo)記的高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)技術(shù)檢測了NAFLD患者血漿外泌體蛋白，篩選出差異蛋白，通過生物信息學(xué)技術(shù)分析它們的功能，為尋找無創(chuàng)檢測NAFLD手段提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2020年7月～10月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院就診的NAFLD患者3例和健康體檢者3例，年齡為16～65歲。診斷依據(jù)2018年發(fā)布的非酒精性脂肪性肝病防治指南，無飲酒史或者過去12個月每周男性飲用酒精(折合乙醇量) <210 g，女性 <140 g，肝活檢組織學(xué)改變符合非酒精性脂肪性肝病的病理學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)、基因3型丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染、自身免疫性肝炎、肝豆?fàn)詈俗冃缘瓤蓪?dǎo)致脂肪肝的特定肝病；(2)藥物(他莫昔芬、乙胺碘呋酮、丙戊酸鈉、 甲氨蝶呤、糖皮質(zhì)激素等)、全胃腸外營養(yǎng)、炎癥性腸病、乳糜瀉、甲狀腺功能減退癥、庫欣綜合征、β脂蛋白缺乏血癥、脂質(zhì)萎縮性糖尿病、Mauriac 綜合征等導(dǎo)致脂肪肝的特殊情況。本研究得到首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑和儀器 碳酸氫銨(Sigma-Aldrich)、尿素(Amresco)、蛋白定量染液(Huaxingbio)、二硫蘇糖醇(DTT，Amresco)、碘代乙酰胺(IAM，Amresco)、胰蛋白酶(Promega)、乙腈(J.T.Baker)、甲酸(Sigma-Aldrich)、XBridge Peptide BEH 5 μm C18色譜柱(Waters)、TMT6plexIsobaric Label Reagent Set(Thermofisher，貨號：90111)；超速離心機(jī) (Beckman，OptimaTMXPN-100)、高效液相色譜系統(tǒng)(8600RIGOL L-3000)、超聲破碎儀(上海滬析實(shí)業(yè)有限公司)、離心機(jī)(Eppendorf)、酶標(biāo)儀(DR200B)，電泳系統(tǒng)(Bio-rad)。

1.3 血漿外泌體蛋白的提取 取血漿，4℃ 2000 rcf離心10 min，去除死細(xì)胞，繼續(xù)10000 rcf離心30 min，去除細(xì)胞碎片和大分子雜質(zhì)，將上清移至超速離心管，4℃ 110000 rcf 超速離心70 min，提純外泌體，加入適量的尿素(濃度8 mol/L)和蛋白酶抑制劑混勻，超聲裂解，4℃ 140 00 rcf離心20 min，取上清，測定蛋白質(zhì)濃度，并行SDS-PAGE電泳質(zhì)控。

1.4 蛋白標(biāo)本的制備 取上述提取的蛋白100 μg，加入二硫蘇糖醇(濃度10 mmol/L)，30℃ 1 h，加入碘代乙酰胺(濃度40 mmol/L)，室溫45 min，隨后用碳酸氫銨(濃度25 mmol/L)將樣本稀釋4倍，按胰酶：蛋白1∶50的比例加入胰酶，37℃過夜，加入0.1%甲酸50μl終止酶解，將酶解后的肽段用C18柱除鹽后進(jìn)行真空冷凍干燥，取干凈EP管，每管加入TMT試劑0.8 mg和無水乙醇41 μl，震蕩5 min，加入酶切后的蛋白100μg，室溫孵育1 h，將標(biāo)記好的蛋白真空冷凍干燥，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 數(shù)據(jù)采集 本報告采用Orbitrap Fusion型質(zhì)譜采集LC-MS/MS數(shù)據(jù)，配制流動相 A 液(100%水、0.1%甲酸)和 B 液(100%乙腈、0.1%甲酸)，用A液10 μl溶解凍干粉末，4℃下14000 rcf 離心 20 min，取上清樣品 1 μg，行液質(zhì)檢測。使用 Orbitrap Fusion質(zhì)譜儀和Nanospray FlexTM(NSI)離子源，設(shè)定離子噴霧電壓為 2.2 kv，離子傳輸管溫度為350℃，采用數(shù)據(jù)依賴型采集模式質(zhì)譜，全掃描范圍為 350～1550 m/z，一級質(zhì)譜分辨率設(shè)為120000(200 m/z)，C-trap最大容量為 4×105，C-trap 最大注入時間為 50 ms。選擇全掃描中離子強(qiáng)度 TOP20的母離子和高能碰撞裂解(HCD)法碎裂，進(jìn)行二級質(zhì)譜檢測。二級質(zhì)譜分辨率設(shè)為 60000(200 m/z)，C-trap 最大容量為 1×105，C-trap 最大注入時間為118 ms，肽段碎裂碰撞能量設(shè)為28%，閾強(qiáng)度設(shè)為 5×104，動態(tài)排阻范圍設(shè)為15 s，生成質(zhì)譜，檢測原始數(shù)據(jù)。

1.6 蛋白鑒定和定量分析 由Orbitrap Fusion型質(zhì)譜完成TMT質(zhì)譜分析，應(yīng)用Power Designer 2.4處理產(chǎn)生的質(zhì)譜原始文件，檢索homo_sapiens_uniprot_2020_08_ 13.fasta數(shù)據(jù)庫，對蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定和定量分析，最后以倍數(shù)上調(diào)>1.2倍或下調(diào)>1.2倍且P<0.05 為標(biāo)準(zhǔn)，篩選差異蛋白質(zhì)。

1.7 生物學(xué)信息分析 通過Uniprot的注釋信息對差異蛋白進(jìn)行基因功能(GO)注釋，采用Fisher精確檢驗(yàn)，對差異蛋白進(jìn)行功能(GO)富集分析，應(yīng)用R-3.5.1軟件對差異蛋白進(jìn)行層次聚類分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用Persuse軟件平臺[8](http://www.perseus-framework.org蛋白組學(xué)分析軟件平臺)進(jìn)行蛋白組學(xué)前期數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 蛋白鑒定和定量分析情況 共鑒定到3419個肽段和387種蛋白。經(jīng)蛋白質(zhì)定量分析，共篩選出34種差異表達(dá)蛋白，其中與健康體檢者相比上調(diào)的蛋白25種，下調(diào)的蛋白9種(圖1、表1、表2)。

2.2 差異蛋白GO功能富集分析情況 對篩選出的差異蛋白進(jìn)行功能分類，發(fā)現(xiàn)這些差異蛋白的功能主要集中在低密度脂蛋白顆粒重構(gòu)、脂蛋白分解代謝、活性氧反應(yīng)調(diào)節(jié)、纖維素形成調(diào)節(jié)、脂質(zhì)儲存調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、核糖體、蛋白酶復(fù)合物、脂蛋白顆粒、細(xì)胞膜等細(xì)胞組分；肝素結(jié)合、低密度脂蛋白受體結(jié)合、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性調(diào)節(jié)、信號受體結(jié)合、脂肪酶結(jié)合、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶活性調(diào)節(jié)等分子功能(圖2)。

圖2 差異蛋白在GO二級分類中統(tǒng)計分布圖biological process(BP)：生物過程；cellular component(CC):細(xì)胞組分；molecular function(MF)：分子功能；條形圖表示富集程度

2.3 差異蛋白KEGG通路分析情況 將篩選出的差異蛋白進(jìn)行KEGG通路富集分析，發(fā)現(xiàn)差異蛋白主要集中于糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路、胰島素抵抗、腎素-血管緊張素系統(tǒng)、鞘脂信號通路、補(bǔ)體和凝血級聯(lián)反應(yīng)等信號通路(圖3)。

圖3 差異蛋白在KEGG通路中富集分布?xì)馀輬D顏色代表富集度[-log10(P value)]，圓圈大小表示基因數(shù)目

2.4 差異蛋白相互作用分析情況 將所得的差異蛋白進(jìn)一步進(jìn)行相互作用網(wǎng)絡(luò)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有13種差異蛋白被互作網(wǎng)絡(luò)覆蓋(圖4)，說明它們之間具有較好的生物學(xué)聯(lián)系，其余蛋白則游離于相互作用網(wǎng)絡(luò)之外，可能其功能較為獨(dú)立或者與其他差異蛋白功能較疏遠(yuǎn)。

圖4 部分差異蛋白相互作用(PPI)紅色節(jié)點(diǎn)為上調(diào)蛋白，綠色節(jié)點(diǎn)為下調(diào)蛋白

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)外泌體存在多種生物分子，包括mRNA、miRNA、DNA、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等[9]，尤其是蛋白質(zhì)，已發(fā)現(xiàn)的外泌體上的蛋白有9000多種，其中許多在細(xì)胞間信息交流過程中具有重要的生物學(xué)功能[10,11]。以質(zhì)譜技術(shù)為基礎(chǔ)的蛋白組學(xué)作為蛋白質(zhì)鑒定、定量和表征蛋白質(zhì)翻譯后修飾的工具[12]，并能進(jìn)一步提供蛋白質(zhì)間相互作用的機(jī)制、相關(guān)功能的注釋及與疾病之間關(guān)聯(lián)的重要信息，而外泌體蛋白的分析發(fā)展尤為迅速[13,14]，特別是臨床樣本來源的外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)分析已經(jīng)被應(yīng)用于尋找疾病診斷的早期標(biāo)志物和疾病治療的新靶點(diǎn)[15,16]。

本研究共篩選出差異蛋白34個，其中上調(diào)的蛋白25種，下調(diào)的蛋白9種，其功能歸納如下：(1)在NAFLD患者血漿外泌體差異蛋白上調(diào)組中，我們發(fā)現(xiàn)了視黃醇結(jié)合蛋白4(retinol binding protein4，RBP4)，是一種脂質(zhì)運(yùn)載蛋白家族的蛋白質(zhì)，肝細(xì)胞被認(rèn)為是正常條件下RBP4分泌的主要來源[17]。在人體實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，較高水平的RBP4被證明與肝臟脂肪蓄積增加有關(guān)[18]，而阻斷動物肝臟RBP4表達(dá)足以減少C57BL/6小鼠脂質(zhì)并改善高脂飲食誘導(dǎo)的肝脂肪變性，證實(shí)RBP4在調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝中的潛在作用[19]；(2)玻連蛋白(vitronectin，VTN)是一種細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)蛋白，主要起源于肝臟，并作為血漿成分在血液中循環(huán)[20]。研究表明，αvβ3整聯(lián)蛋白是VTN受體之一，是肝星狀細(xì)胞(HSC)增殖、遷移、存活和促纖維化基因表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑。NAFLD包括非酒精性肝脂肪變(non-alcoholic hepatic steatosis，NAFL)和NASH。NASH具有肝細(xì)胞脂肪變性、氣球樣變、炎癥和纖維化，而肝纖維化是由ECM產(chǎn)生和降解之間的不平衡引起的。VTN誘導(dǎo)的HSC活化可能作為肝纖維化發(fā)展過程中ECM蛋白產(chǎn)生的來源。因此，RBP4和VTN均可能是診斷NAFLD的早期血清學(xué)標(biāo)志物。

在NAFLD的疾病發(fā)展過程中肝細(xì)胞的脂肪變作為疾病發(fā)展的首要因素，我們在此次蛋白組學(xué)分析中發(fā)現(xiàn)了與脂代謝密切相關(guān)的載脂蛋白，將其總結(jié)如下：(1)血漿外泌體差異蛋白上調(diào)組中的載脂蛋白B(apolipoprotein B，ApoB)和載脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE):肝臟是循環(huán)ApoE的主要來源。ApoB是促炎狀態(tài)的預(yù)測指標(biāo)；(2) 血漿外泌體差異蛋白下調(diào)組中的載脂蛋白A(apolipoprotein A，ApoA)和載脂蛋白D(apolipoprotein D ，ApoD): ApoA-1主要作為高密度脂蛋白(HDL)的一種成分存在于血漿，在生物發(fā)生過程中起著重要作用。

NASH的病理過程包括肝細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。在血漿外泌體上發(fā)現(xiàn)多種上調(diào)和下調(diào)的炎癥因子，其中蛋白多糖4(proteoglycan 4，PRG4)、跨膜通道樣蛋白家族成員跨膜通道樣蛋白8(transmembrane channel-like protein 8，TMC8)和α-1抗胰蛋白酶(α-1-antitrypsin，AT)等都有重要的作用。本研究結(jié)果表明，PRG4、TMC8和AT等炎癥因子可能參與了NAFLD發(fā)病過程中的炎癥反應(yīng)，因處于不同的病理學(xué)過程時期而表現(xiàn)為上調(diào)和下調(diào)，有可能作為早期診斷NAFLD的血清學(xué)標(biāo)志物。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：張文彥和劉芳負(fù)責(zé)實(shí)施研究過程和采集整理數(shù)據(jù)；劉夢露負(fù)責(zé)調(diào)研整理文獻(xiàn)；陳德喜負(fù)責(zé)修訂論文；張晶負(fù)責(zé)患者入組及標(biāo)本的收集；于海濱和時紅波負(fù)責(zé)提出研究選題、設(shè)計研究方案和修訂論文。