羅真真，田海英，葛建華，紀 元

慢性丙型肝炎(chronic hepatitis C，CHC)是由丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染所致的慢性肝損傷性疾病。HCV感染慢性化的風險高于其他類型的嗜肝病毒感染[1]。目前認為，CHC患者肝纖維化進展與HCV基因分型有關，而基因3型HCV對肝細胞脂質代謝的影響較大，且與肝纖維化、肝硬化和肝細胞癌的發(fā)生風險增加有關[2，3]。N-寡糖是結合糖蛋白的天冬酰胺側鏈氨基上的分支寡糖鏈，主要由肝臟和B淋巴細胞合成，可反映肝臟細胞的生理改變[4]?？偰懼?total bile acid，TBA)是一項靈敏的肝功能檢測指標，在肝細胞出現(xiàn)輕微損傷時就表現(xiàn)為明顯的升高趨勢。有研究發(fā)現(xiàn)，肝硬化患者血清TBA異常率很高[5]。肝臟硬度檢測(liver stiffness measurement，LSM)是使用瞬時彈性成像技術檢測的肝臟硬度變化的物理參數(shù)，具有無創(chuàng)、高效的特點。慢性乙型肝炎患者LSM隨著肝纖維化程度的增加而升高[6]。本研究檢測了CHC患者血清N-寡糖和TBA水平的變化，以探討應用其判斷肝纖維化的臨床價值，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2018年6月～2021年6月我院收治的CHC患者84例，男51例，女33例；年齡為43～72歲，平均年齡為(58.7±5.6)歲。符合《丙型肝炎防治指南(2015年更新版)》[7]的診斷標準。排除標準：①合并乙型肝炎病毒感染；②合并酒精性肝病、自身免疫性肝病；③合并惡性腫瘤。另選擇健康體檢者51例，男29例，女22例；年齡為40～69歲，平均年齡為(57.9±6.1)歲。兩組人群性別和年齡比較無顯著性差異(P>0.05)。

1.2 血清TBA水平檢測 使用美國貝克曼庫爾特公司生產(chǎn)的5831型全自動生化分析儀檢測。

1.3 血清N-寡糖水平檢測 取血清3 μL，加入10 mmol/L NH4HCO3緩沖液2μL和去離子水3μL，加入RCR反應板，95℃下加熱5 min，放置于4℃環(huán)境，加入PNGase F(2.2 U/μL)3 μL，于37℃下孵育3 h，4℃水浴后加入去離子水100μL，終止反應，記為D板。從D板吸取10μL溶液，加入PCR反應板，在60℃下烘干約90 min，直至完全干燥。加入標記溶液3 μL，在90℃下反應2 h，加入去離子水終止反應。取樣本2μL，加入唾液酸酶0.2 μL，震蕩混勻后于42℃下孵育4 h，加去離子水終止反應。取10μL溶液，用ABI3500DX測序儀進行N-聚糖圖譜分析，經(jīng)GeneMapper軟件處理，根據(jù)量化后的峰值數(shù)據(jù)計算N-寡糖相對水平。

1.4 LSM測定 使用法國Echosens 提供的Fibroscan-502 Touch儀器檢測，于右腋中線第7、8或8、9肋間檢測，連續(xù)有效檢測10次，最終成功率大于60%，取均值。

1.5 肝活檢 常規(guī)行肝活檢，參照METAVIR評分系統(tǒng)[8]將肝纖維化分為S1、S2、S3和S4期。將肝纖維化程度分為進展期纖維化(S3～S4)和輕度纖維化(S1～S2)。

2 結果

2.1 兩組血清N-寡糖、TBA水平和LSM比較 CHC組血清N-寡糖、TBA水平和LSM值顯著大于對照組(P<0.05，表1)。

表1 兩組血清N-寡糖、TBA水平和比較

2.2 不同纖維化分期的CHC患者血清N-寡糖、TBA水平和LSM值比較 隨著肝纖維化程度的加重，CHC患者血清N-寡糖、TBA水平和LSM值逐漸顯著升高或增大(P<0.05，表2)。

表2 不同纖維化分期患者血清N-寡糖、TBA水平和LSM值比較

2.3 血清N-寡糖、TBA水平和LSM值評估進展期肝纖維化的價值情況 進展期纖維化患者血清N-寡糖和TBA水平顯著高于輕度纖維化患者，LSM值顯著大于輕度纖維化患者(P<0.05)。繪制血清N-寡糖、TBA水平和LSM值診斷進展期肝纖維化的ROC曲線，結果顯示，聯(lián)合檢測評估CHC患者進展期肝纖維化的AUC大于各指標單項檢測(P<0.05，表3、圖1)。

表3 血清指標和LSM評估進展期肝纖維化的效能(%)情況

圖1 血清N-寡糖、TBA水平和LSM值評估進展期肝纖維化的ROC曲線分析

3 討論

N-寡糖是一種新型肝臟疾病血清標志物，主要由肝臟和B淋巴細胞合成，可反映肝臟或B淋巴細胞的生理和病理學改變。健康人體血液糖蛋白上連接的寡糖結構是相對穩(wěn)定的，其相對含量也基本固定。當肝臟功能出現(xiàn)異常時，肝臟的糖蛋白合成代謝也會有所改變，使寡糖的結構和含量發(fā)生變化[9,10]。膽汁酸的前體為膽固醇，屬于一種有機酸，由多種成份構成，其合成和分解代謝主要在肝臟中完成。血清TBA的合成和分泌由肝細胞完成，是組成膽汁的主要成分，與脂類的消化、吸收密切相關[11，12]。當發(fā)生肝纖維化時，正常肝細胞遭到破壞，功能性肝細胞數(shù)量開始下降，從而使對TBA的汲取量降低[13]。同時，門靜脈回流而來的TBA未得到充分的吸收。因為側支循環(huán)的出現(xiàn)使門靜脈中部分血液進入體循環(huán)，導致血清TBA水平升高。本研究發(fā)現(xiàn)，CHC患者血清N-寡糖和TBA水平升高，LSM值增大，與相關研究結果相符。在肝纖維化形成過程中，肝內結締組織異常增生，導致肝內彌漫性細胞外基質過度沉淀而引發(fā)肝臟硬度增大[14]。本研究結果顯示，進展期肝纖維化患者血清N-寡糖和TBA水平及LSM值較輕度肝纖維化患者升高，提示肝纖維化越嚴重，這些指標的水平就越高。

肝組織學檢查依然是臨床上診斷肝病患者肝纖維化的金標準，但其具有創(chuàng)傷性，可能存在一定的不良后果，可重復性差[15]。血清肝纖維化標記物檢測是一種無創(chuàng)性檢查方法，雖具有無創(chuàng)性、操作簡單、可重復性高等優(yōu)點，但易受其他條件的影響，準確性相對偏低[16]。相關研究指出，在血清學檢查的基礎上給予影像學聯(lián)合檢查，或可起到提高診斷準確度的作用[17，18]。本研究對不同肝纖維化患者血清N-寡糖、TBA水平及LSM值進行檢測，發(fā)現(xiàn)隨著肝纖維化程度的加重，CHC患者血清N-寡糖、TBA水平逐漸升高，LSM值逐漸增大，表明血清N-寡糖、TBA水平及LSM值與肝纖維化程度相關，主要是因為血清N-寡糖水平越高，表示肝臟受損越嚴重。TBA是肝臟分泌產(chǎn)物，其進入腸道后大部分被重吸收，從門靜脈再次進入肝臟，而肝纖維化患者因肝細胞受損嚴重，導致其攝取TBA的功能下降，且側支循環(huán)的存在使得富含TBA的血液繞過肝臟進入體循環(huán)，最終導致血清TBA水平增高[19，20]，提示或可通過檢測血清指標及LSM值來評估肝纖維化程度。本研究發(fā)現(xiàn)，血清N-寡糖、TBA水平及LSM值聯(lián)合檢測評估CHC患者進展期肝纖維化的AUC為0.918，顯著高于各單項檢測，提示聯(lián)合檢測對CHC患者肝纖維化程度具有評估價值。本研究經(jīng)進一步分析發(fā)現(xiàn)，確立血清N-寡糖和TBA水平及LSM的診斷截斷點，評估CHC患者肝纖維化程度，具有可操作性，臨床應用價值值得進一步探討。肝纖維化是一個動態(tài)的發(fā)展過程，CHC患者肝功能受損程度隨纖維化程度的加重而加重，故本研究認為，用于反映肝臟受損程度的血清N-寡糖和TBA水平或也同樣可用于評估肝纖維化程度。

綜上所述，CHC患者血清N-寡糖和TBA水平升高，LSM值增加，應用血清N-寡糖和TBA水平聯(lián)合LSM評估CHC患者肝纖維化程度具有臨床價值，值得進一步研究和驗證。