張 纓，江龍委，秦 峰，賈紹昌

近年來(lái)，越來(lái)越多的研究者使用患者來(lái)源的斑馬魚(yú)異種移植(zebrafish patient derived xenograft，zPDX)研究腫瘤的發(fā)生[1-3]。一些zPDX 模型也成功建立[4，5]。與小鼠異種移植模型比，透明斑馬魚(yú)幼蟲(chóng)異種移植模型可以在活體內(nèi)直接觀(guān)察移植的癌細(xì)胞，能同時(shí)研究腫瘤的生長(zhǎng)和遷移[1,6]。肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)嚴(yán)重威脅著人類(lèi)健康，每年新發(fā)HCC病例約為80萬(wàn)例[7]。盡管已有各種新的治療方法被用于治療HCC患者，但總體生存率仍然很低[8]，主要是由于手術(shù)切除后腫瘤容易復(fù)發(fā)和遷移，導(dǎo)致HCC患者病死率居高不下[9]。長(zhǎng)鏈非編碼核糖核酸(long non-coding RNA，lncRNA)是一類(lèi)非編碼轉(zhuǎn)錄物(>200 個(gè)核苷酸)[9]。越來(lái)越多的研究證明，lncRNA在多種生理和病理學(xué)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[10]，包括HCC細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和耐藥過(guò)程[11]。近期研究表明，一些lncRNA在HCC細(xì)胞遷移過(guò)程中存在競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)源性RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)機(jī)制[12-14]。同源異形基因D簇反義核糖核酸1 (HOXD cluster antisense RNA 1，HOXD-AS1，也被稱(chēng)為 HAGLR)是一種lncRNA，可以作為神經(jīng)母細(xì)胞瘤進(jìn)展的標(biāo)志物[15]。它是人類(lèi)染色體2q31.2上的HOXD簇以反義方式轉(zhuǎn)錄的，包含八個(gè)外顯子[15]。已有研究證明，HOXD-AS1可以作為與miRNA結(jié)合的ceRNA在HCC、肺癌、卵巢癌、膠質(zhì)瘤、乳腺癌、結(jié)直腸癌、膽管癌和宮頸癌等多種癌癥中發(fā)揮作用[15，16]。但是，這些研究都缺乏直觀(guān)的體內(nèi)證據(jù)，而zPDX可為lncRNA研究提供快速直觀(guān)的癌癥遷移模型[17]。我們嘗試使用zPDX模型建立了lncRNA體內(nèi)研究方法。

1 資料與方法

1.1 斑馬魚(yú)的養(yǎng)殖 將成年斑馬魚(yú)(南京歆佳醫(yī)藥科技有限公司)維持在 28℃魚(yú)類(lèi)自動(dòng)培養(yǎng)系統(tǒng)(中國(guó)海神公司)。本研究使用了AB 野生型和Tg(fli1a:EGFP) 轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 采用HCC細(xì)胞系HepG2、Hep3B、Huh7和正常肝細(xì)胞系LO2細(xì)胞，所有細(xì)胞均于 2019年購(gòu)自中國(guó)上海寸邁生物科技有限公司，均通過(guò)微衛(wèi)星DNA(microsatellite DNA，STR)測(cè)試驗(yàn)證，經(jīng)PCR法檢測(cè)支原體陰性。

1.3 細(xì)胞RNA提取和qRT-PCR檢測(cè) 常規(guī)提取細(xì)胞RNA，基因特異性引物的序列為，HOXD-AS1-F: 5′-ATTCGTCTGACTTGGCTCTT-3′；HOXD-AS1-R: 5′-CCTGTTTTGACCTTTTCCTG-3′；GAPDH-F:5′-GGGAGCCAAAAGGGTCAT-3′； GAPDH-R:5′-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3′。

1.4 siRNA和miRNA抑制劑轉(zhuǎn)染細(xì)胞 使用 Lipofectamine 3000試劑(Thermo Fisher Scientific，美國(guó))轉(zhuǎn)染細(xì)胞特定的siRNA或miRNA抑制劑。我們從General Biosystems(中國(guó))購(gòu)買(mǎi)了兩種HOXD-AS1 siRNA、miR-130a-3p抑制劑和陰性對(duì)照(negative control，NC)siRNA。HOXD-AS1 siRNA 序列如下[16]：si1-HOXD-AS1：5′-GAAAGAAGGACCAAAGTAA-3′；si2-HOXD-AS1：5′-GCACAAAGGAACAAGGAAA-3′；NC siRNA序列是 5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′。

1.5 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 使用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(CCK-8，DOJINDO，日本)進(jìn)行細(xì)胞增殖測(cè)定。

1.6 細(xì)胞侵襲試驗(yàn) 用HOXD-AS1和NC siRNA轉(zhuǎn)染Hep3B和Huh7細(xì)胞。用Transwell法檢測(cè)侵襲情況。

1.7 zPDX模型的建立 注射前，將肝癌細(xì)胞Hep3B和Huh7(中國(guó)上海寸邁公司)用熒光染料CM-DiI(Invitrogen，美國(guó))標(biāo)記。方案如下：收集細(xì)胞，用HBSS洗滌3次。將細(xì)胞用CM-DiI在37℃下標(biāo)記5 min，再在4℃下標(biāo)記15 min。用HBSS漂洗3次，去除未結(jié)合的染料，即制備好了標(biāo)記的細(xì)胞。將標(biāo)記的癌細(xì)胞注射到受精后48 h的斑馬魚(yú)幼蟲(chóng)的卵周間隙(perivitelline space，PVS)。將每條斑馬魚(yú)幼蟲(chóng)固定在1.2%低熔點(diǎn)凝膠中，通過(guò)微量注射器將約300～400個(gè)細(xì)胞植入PVS。注射后，將斑馬魚(yú)幼蟲(chóng)異種移植物在34℃培養(yǎng)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。在注射后1d，選擇成功注射的具有相似腫瘤大小的異種移植物用于以下實(shí)驗(yàn)。

1.8 斑馬魚(yú)體內(nèi)成像和定量分析 在注射后第4 d，將斑馬魚(yú)幼蟲(chóng)安裝在1.2%低熔點(diǎn)凝膠中，通過(guò)立體顯微鏡(MVX10，Olympus，日本)或使用20×水浸物鏡(Fluoview 3000，Olympus，日本)的共聚焦顯微鏡拍攝圖像。圖像的空間分辨率為1600×1200(MVX10)或1024×1024像素(Fluoview 3000)。應(yīng)用ImageJ軟件對(duì)圖像進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果

2.1 HCC細(xì)胞HOXD-AS1呈高水平 經(jīng)qRT-PCR檢測(cè)顯示，HepG2、Hep3B 和 Huh7細(xì)胞HOXD-AS1水平分別顯著高于LO2 細(xì)胞(65.6±5.7)、(4.6±0.5)和(23.4±1.0)倍(P<0.001)；在轉(zhuǎn)染siRNA 24 h后，與NC細(xì)胞比，第一條siRNA(si1-HOXD-AS1)在HepG2、Hep3B和Huh7細(xì)胞對(duì)HOXD-AS1的敲減率分別為40.9%、96.6%和75.7%，第二條siRNA(si2-HOXD-AS1)的敲減率分別為3.9%、41.0% 和 45.2%?；谇玫托蕯?shù)據(jù)，我們選擇Hep3B和Huh7 細(xì)胞進(jìn)行下一步研究。

2.2 敲低HOXD-AS1在體外和體內(nèi)抑制Hep3B細(xì)胞增殖和遷移 在轉(zhuǎn)染si1-HOXD-AS1后，Hep3B細(xì)胞增殖活性顯著降低，而在轉(zhuǎn)染si2-HOXD-AS1后細(xì)胞增殖水平并無(wú)顯著變化(圖1A)。經(jīng)Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，敲低HOXD-AS1后Hep3B細(xì)胞每視野細(xì)胞數(shù)為49.6±3.9，顯著低于對(duì)照組的221.8±63.3(P<0.01)，提示敲低HOXD-AS1后Hep3B細(xì)胞侵襲能力受到抑制(圖1B)。在zPDX實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，代表細(xì)胞增殖的蛋黃CM-DiI陽(yáng)性信號(hào)量化區(qū)域信號(hào)為對(duì)照組的56.0±12.0%(P<0.01)，提示敲低體內(nèi)HOXD-AS1降低了Hep3B細(xì)胞的增殖能力(圖1C～E)。代表遷移的軀干CM-DiI陽(yáng)性信號(hào)為對(duì)照的49.0±8.9%(P<0.05)，提示在體內(nèi)敲低HOXD-AS1也降低了Hep3B細(xì)胞的遷移(圖1F～H)。

圖1 敲低HOXD-AS1抑制Hep3B細(xì)胞增殖和遷移A：轉(zhuǎn)染HOXD-AS1或NC siRNA后Hep3B細(xì)胞增殖；B：轉(zhuǎn)染HOXD-AS1或NC siRNA后Hep3B細(xì)胞侵襲；C：經(jīng)HOXD-AS1或NC siRNA轉(zhuǎn)染的Hep3B細(xì)胞注射到2-dpf Tg(fli1a:EGFP)斑馬魚(yú)幼蟲(chóng)的PVS；D：使用共聚焦顯微鏡以每英寸點(diǎn)數(shù)(dots per inch，dpi)拍攝蛋黃圖像，顯示量化蛋黃CM-DiI陽(yáng)性區(qū)域增殖情況；E：C圖和D圖信號(hào)統(tǒng)計(jì)分析；F/G：使用共聚焦顯微鏡以4dpi拍攝軀干圖像，量化軀干CM-DiI陽(yáng)性區(qū)域的遷移情況(箭頭代表一些遷移細(xì)胞。該區(qū)域的放大視圖顯示了典型的遷移細(xì)胞；H：F圖和G圖信號(hào)統(tǒng)計(jì)分析大小：100 μm。*：P<0.05，**：P<0.01

2.3 敲低HOXD-AS1在體外和體內(nèi)抑制Huh7細(xì)胞增殖和遷移 與Hep3B細(xì)胞實(shí)驗(yàn)相同，在Huh7細(xì)胞轉(zhuǎn)染si1-HOXD-AS1后，僅在72 h細(xì)胞增殖活性降低，為對(duì)照組的68.2±15.4%(P<0.001)，其余時(shí)間點(diǎn)均無(wú)顯著差異，但Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，敲低HOXD-AS1后Huh7細(xì)胞每視野細(xì)胞數(shù)為54.2±15.2，顯著低于對(duì)照組的226.8±26.3(P<0.01)，提示敲低HOXD-AS1抑制了Huh7細(xì)胞的侵襲。在zPDX實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，代表細(xì)胞增殖的蛋黃CM-DiI陽(yáng)性信號(hào)為對(duì)照組的46.5±16.8%(P<0.01)，提示在體內(nèi)敲低HOXD-AS1降低了Huh7細(xì)胞增殖。代表遷移的軀干中CM-DiI陽(yáng)性信號(hào)為對(duì)照組的41.9±10.2%(P<0.01)，提示在體內(nèi)敲低HOXD-AS1也降低了Huh7細(xì)胞的遷移能力。

2.4 敲低miR-130a-3p可促進(jìn)體外和體內(nèi)HCC細(xì)胞遷移 為了進(jìn)一步研究HOXD-AS1在HCC遷移過(guò)程中的作用，我們選擇與其競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合的miRNA之一miR-130a-3p進(jìn)行驗(yàn)證。在miR-130a-3p被其抑制劑敲低后，Huh7細(xì)胞每視野細(xì)胞數(shù)為39.0±9.2，顯著高于對(duì)照組的24.4±7.2(P<0.001)，提示Huh7細(xì)胞的侵襲能力顯著增強(qiáng)(圖2A)。將miR-130a-3p抑制劑轉(zhuǎn)染的細(xì)胞移植到斑馬魚(yú)幼蟲(chóng)后，軀干CM-DiI陽(yáng)性細(xì)胞也顯著增多，為對(duì)照組的187.8±42.7%(P<0.05，圖2B)。

圖2 抑制miR-130a-3p提升Huh7細(xì)胞的遷移能力A:轉(zhuǎn)染miR-130a-3p抑制劑或NC抑制劑后Huh7細(xì)胞侵襲能力變化；B：將經(jīng)miR-130a-3p抑制劑或NC抑制劑轉(zhuǎn)染的Huh7細(xì)胞注射到2-dpf Tg(fli1a:EGFP)斑馬魚(yú)幼蟲(chóng)的PVS，量化軀干CM-DiI陽(yáng)性區(qū)域的遷移情況大?。?00 μm。*：P<0.05，***：P<0.01

2.5 敲低miR-130a-3p在Huh7細(xì)胞挽救因HOXD-AS1下調(diào)導(dǎo)致的細(xì)胞遷移能力下降 本研究將si1-HOXD-AS1和miR-130a-3p抑制劑共轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞，檢測(cè)體內(nèi)外細(xì)胞遷移能力。結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染組、si1-HOXD-AS1組和NC組每視野細(xì)胞數(shù)分別為78.2±15.3、39.3±9.5、79.4±18.3，差異顯著(P<0.01)，提示在體外敲低miR-130a-3p能挽救因HOXD-AS1下調(diào)導(dǎo)致的細(xì)胞遷移能力下降(圖3A)。在zPDX中，si1-HOXD-AS1組和共轉(zhuǎn)染組CM-DiI陽(yáng)性細(xì)胞分別為NC組的48.9±13.5%(P<0.05)和109.4±24.9%(P>0.05，圖3B)。

圖3 抑制miR-130a-3p能挽救因HOXD-AS1下調(diào)導(dǎo)致的細(xì)胞遷移能力下降A(chǔ)：共轉(zhuǎn)染si1-HOXD-AS1和miR-130a-3p抑制劑后Huh7細(xì)胞侵襲能力變化；B：在zPDX檢測(cè)共轉(zhuǎn)染si1-HOXD-AS1和miR-130a-3p抑制劑后Huh7細(xì)胞在體內(nèi)的遷移能力大小：100 μm。*：P<0.05，**：P<0.01

3 討論

在本研究，我們首先利用zPDX驗(yàn)證了HOXD-AS1在不同HCC細(xì)胞呈高水平。接著，在體外培養(yǎng)細(xì)胞和zPDX沉默HOXD-AS1基因，評(píng)估肝癌細(xì)胞增殖和侵襲能力，檢測(cè)與HOXD-AS1競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的miR-130a-3p在腫瘤遷移中的作用，我們發(fā)現(xiàn)抑制miR-130a-3p可以挽救肝癌細(xì)胞遷移，體外和體內(nèi)敲低HOXD-AS1基因可降低肝癌細(xì)胞遷移，表明zPDX可能是一種可靠的人類(lèi)癌癥遷移實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚17]。

與小鼠模型比，zPDX在腫瘤生物學(xué)方面顯示出更多的優(yōu)勢(shì)[18，19]。在移植后4天內(nèi)，通過(guò)zPDX可以檢測(cè)HOXD-AS1對(duì)細(xì)胞遷移的作用，而小鼠模型至少需要4周。本文主要研究肝癌細(xì)胞的遷移，也可分析細(xì)胞增殖。結(jié)合不同的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)系，還可以研究肝癌細(xì)胞微環(huán)境，例如Tg(fli1a:EGFP)轉(zhuǎn)基因系可以用于研究腫瘤血管生成。在本研究，我們發(fā)現(xiàn)了Hep3B和Huh7細(xì)胞之間的生長(zhǎng)差異，因?yàn)镠uh7細(xì)胞生長(zhǎng)方式比Hep3B細(xì)胞更集中。

最近的研究表明，一些lncRNA，如ceRNA，可以通過(guò)與miRNA競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合調(diào)節(jié)miRNA靶標(biāo)水平，從而影響腫瘤的進(jìn)展[20]。本文同樣證實(shí)了敲低HOXD-AS1的ceRNA之一miR-130a-3p可以促進(jìn)HCC細(xì)胞遷移，而敲低HOXD-AS1能抑制HCC細(xì)胞遷移。同時(shí)，敲低miR-130a-3p可以在體內(nèi)外挽救因HOXD-AS1下調(diào)導(dǎo)致的細(xì)胞遷移能力下降。