任潔雯，李宗怡，任嘉欣，賴鳴杰

原發(fā)性肝癌(PLC)是世界第六大常見癌癥之一，死亡率居所有癌癥的第二位[1]。過去幾十年里，PLC的發(fā)病率逐年升高，肝細(xì)胞癌(HCC)是最常見的原發(fā)性PLC，也是PLC最常見的組織學(xué)類型，約占PLC的90%左右[2]。手術(shù)切除、化療、放療、介入治療和全身治療是常用的治療手段[3]，但大多數(shù)患者在確診時已處于腫瘤晚期，失去了治療機(jī)會，導(dǎo)致PLC患者的預(yù)后十分不理想[4]。有研究表明，PLC患者中位生存期僅為9個月，3 a生存率僅為12.7%[5]。近年來，越來越多的傳統(tǒng)中藥及其提取物被發(fā)現(xiàn)具有較好的抗炎和抗腫瘤活性，且安全性較好，毒副作用小[6]。大花旋覆花素(britanin)是從植物大花旋覆花中提取的無色結(jié)晶，先前的研究證實其具有抗過敏和抗炎功效，且對于肝損傷有較好的保護(hù)作用[7]。本實驗采用不同劑量的大花旋覆花素處理人Hep G2細(xì)胞，觀察了細(xì)胞體外增殖和凋亡水平的變化，并探討了其調(diào)控機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人Hep G2細(xì)胞購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫。將細(xì)胞置于含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的RPMI 1640(上海邦景實業(yè)有限公司)培養(yǎng)液中，保持37℃和5% CO2環(huán)境，每隔3 d換液一次。再用0.25%胰蛋白酶(上海穎心實驗室設(shè)備有限公司)消化后、傳代，取對數(shù)生長期的細(xì)胞實驗。

1.2 細(xì)胞處理 取大花旋覆花素(上海源葉生物科技有限公司，藥物純度≥98%)，加入RPMI培養(yǎng)液，配置成5 μmol/L、10 μmol/L和20 μmol/L不同濃度溶液。取經(jīng)上述培養(yǎng)的對數(shù)生長期細(xì)胞，制成5×104個/mL細(xì)胞懸液，接種于96孔板，每孔100μl(約為5×103個細(xì)胞)，培養(yǎng)24 h，加入大花旋覆花素0、5、10和20 μmol/L，處理細(xì)胞48 h。收集處理后的細(xì)胞，檢測細(xì)胞增殖和凋亡。

1.3 細(xì)胞增殖檢測 采用3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽[3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT]法檢測各組細(xì)胞增殖。取經(jīng)不同濃度大花旋覆花素處理的Hep G2細(xì)胞懸液，接種于96孔板，每組設(shè)置3個復(fù)孔。向每孔中加入MTT溶液(上海嶸崴達(dá)實業(yè)有限公司)20 μL，避光條件下共同孵育4 h。向每孔中滴加二甲基亞砜溶液(北京索萊寶科技有限公司)200 μL，充分混合后培養(yǎng)10 min，使用山東競道光電科技有限公司生產(chǎn)的JD-SY96S酶標(biāo)儀檢測波長為450 nm時每孔的吸光度值，計算各組細(xì)胞增殖率。

1.4 細(xì)胞凋亡檢測 收集經(jīng)上述不同濃度藥物處理的細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)洗細(xì)胞2次，將各組細(xì)胞重懸于150 μL緩沖液中，加入Annexin V-FITC 10 μL和碘化丙啶染色液(propidium iodide，PI)5 μL。輕搖離心管,混勻細(xì)胞，4℃條件下避光孵育15 min。按照AnnexinV-FITC/PI凋亡試劑盒(大連美侖生物技術(shù)有限公司)說明書進(jìn)行操作，使用上海三崴醫(yī)療設(shè)備有限公司生產(chǎn)的FACSVia 流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡情況。

1.5 細(xì)胞蛋白表達(dá)檢測 取各組細(xì)胞2×106個，用預(yù)冷的PBS洗細(xì)胞3次，加入細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，收集上清液，采用BCA法測定蛋白濃度。取50 g總蛋白，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，采用電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜。用5%脫脂奶粉于室溫下封閉2 h，用0.05% Tris-Hcl緩沖液洗滌3次。加入一抗[Bax、Bcl2、Caspase3、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin complex，mTORC1)、70S6K、p-mTORC1、p-70S6K和β-actin，濃度均為1:1000，艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司]，在4℃下孵育過夜。加入Tris-Hcl緩沖液洗膜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗兔IgG(濃度為1∶3000)孵育1 h。用Tris-Hcl緩沖液洗膜3次。使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(上海齊源生物科技有限公司)顯色成像，應(yīng)用Image J軟件對各組蛋白條帶進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖率比較 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5 μmol/L、10 μmol/L和20 μmol/L Britanin處理組Hep G2細(xì)胞體外增殖率顯著低于0 μmol/L Britanin(對照組)，且呈濃度依賴性細(xì)胞增殖抑制(P<0.05，圖1)。

圖1 各組細(xì)胞增殖率比較 與Britanin(0 μmol/L)組比，①P<0.05；與Britanin(5 μmol/L)組比，②P<0.05；與Britanin(10 μmol/L)組比，③P<0.05

2.2 各組細(xì)胞凋亡率比較 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5 μmol/L、10 μmol/L和20 μmol/L Britanin處理組Hep G2細(xì)胞凋亡率顯著高于對照組，且呈濃度依賴性細(xì)胞凋亡增多(P<0.05，圖2)。

圖2 各組細(xì)胞凋亡率比較

2.3 各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況比較 結(jié)果顯示，5 μmol/L、10 μmol/L和20 μmol/L Britanin處理組Hep G2細(xì)胞促凋亡蛋白Bax和Caspase3表達(dá)顯著強(qiáng)于對照組，而抑凋亡蛋白的Bcl2表達(dá)顯著弱于對照組，且呈濃度依賴性增強(qiáng)或抑制(P<0.05，圖3、表1)，提示大花旋覆花素可誘導(dǎo)Hep G2細(xì)胞體外凋亡。

圖3 各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況

表1 各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較

2.4 各組細(xì)胞mTORC1通路蛋白表達(dá)情況 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5 μmol/L、10 μmol/L和20 μmol/L Britanin處理組Hep G2細(xì)胞mTORC1和70S6K蛋白表達(dá)顯著弱于對照組，且呈濃度依賴性特征(P<0.05，圖4、表2)。

圖4 各組細(xì)胞mTORC1通路蛋白表達(dá)情況

表2 各組細(xì)胞mTORC1通路蛋白表達(dá)比較

3 討論

PLC是一種癌細(xì)胞生長迅速、惡性程度高的惡性腫瘤之一，早期確診較為困難，60%～80%患者確診時已處于晚期[8]，極大影響患者預(yù)后。體外，癌細(xì)胞具有增殖快、高遷移和侵襲的特點。隨著對PLC的不斷研究和藥物處理的探索，有研究指出，紫杉醇等中藥在治療PLC等惡性腫瘤方面有較好的療效。在抑制腫瘤細(xì)胞增殖的同時，還可顯著提高患者的免疫功能，減少因放化療導(dǎo)致的毒副反應(yīng)的發(fā)生[9]，提高了患者的生存率和生存質(zhì)量。大花旋覆花素是從亞洲和歐洲等地區(qū)生長的植物大花旋覆花中提取的化合物，其有效成分為大花旋覆花內(nèi)酯[10]。國外有研究報道稱，大花旋覆花內(nèi)酯對腫瘤細(xì)胞有較高的細(xì)胞毒性作用[11]。本研究采用不同濃度的大花旋覆花素處理Hep G2細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其可顯著抑制腫瘤細(xì)胞體外增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮較好的抗腫瘤效應(yīng)。

肝細(xì)胞在致瘤因素作用下發(fā)生基因突變，細(xì)胞周期失控，導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)化，腫瘤細(xì)胞持續(xù)分裂和增殖，細(xì)胞異常增生也是肝癌等惡性腫瘤的重要特征[12]。細(xì)胞凋亡作為細(xì)胞內(nèi)程序化死亡的主要方式，惡性腫瘤細(xì)胞調(diào)控細(xì)胞凋亡有關(guān)的分子表達(dá)失衡，凋亡因子被顯著抑制，進(jìn)而造成細(xì)胞發(fā)生凋亡逃逸[13]。Bax和Caspase3是細(xì)胞凋亡的促進(jìn)因子，而Bcl2是細(xì)胞凋亡的抑制因子，其表達(dá)水平的失調(diào)可以在一定程度上反映腫瘤細(xì)胞凋亡的變化情況[14]。本研究觀察了大花旋覆花素對腫瘤細(xì)胞的影響，結(jié)果藥物顯著抑制了Hep G2細(xì)胞增殖，上調(diào)促凋亡蛋白Bax和Caspase3表達(dá)，下調(diào)抑凋亡蛋白Bcl2表達(dá)，顯著誘導(dǎo)了Hep G2細(xì)胞的體外凋亡。大花旋覆花素對于細(xì)胞增殖的調(diào)控可能是通過影響腫瘤細(xì)胞內(nèi)的有絲分裂過程來實現(xiàn)的[15]。大花旋覆花素通過抑制遺傳物質(zhì)向子細(xì)胞傳遞和分裂，抑制其有絲分裂過程，改變了細(xì)胞周期，發(fā)揮顯著的抗增殖效應(yīng)[16]。此外，大花旋覆花素通過改變腫瘤細(xì)胞內(nèi)凋亡關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，上調(diào)Bax和Caspase3等細(xì)胞死亡執(zhí)行蛋白酶的表達(dá)，改變線粒體內(nèi)鈣離子濃度和通透性[17]，抑制Bcl2介導(dǎo)的細(xì)胞毒性，發(fā)揮顯著的促凋亡作用。

研究發(fā)現(xiàn)，多種基因和信號通路在肝癌的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。mTORC1通路是與基因轉(zhuǎn)錄和翻譯、腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡過程有關(guān)的信號通路，在肝癌等惡性腫瘤發(fā)生過程中參與調(diào)控癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡[18]。70S6K作為mTORC1的重要下游分子，受mTORC1調(diào)控，影響細(xì)胞內(nèi)生長因子、氨基酸水平和糖代謝過程。mTORC1/70S6K通路被發(fā)現(xiàn)可作為多種癌癥的治療靶點，在肝癌等惡性腫瘤細(xì)胞中被過度激活[19]，影響癌癥進(jìn)展。本研究發(fā)現(xiàn)，mTORC1/70S6K通路在肝癌細(xì)胞中高表達(dá)，大花旋覆花素可濃度依賴性地抑制mTORC1/70S6K磷酸化水平，進(jìn)而發(fā)揮顯著的抗腫瘤效應(yīng)。我們認(rèn)為，可能與大花旋覆花素對mTORC1的靶向抑制作用有關(guān)，大花旋覆花素靶向結(jié)合溶酶體表面的mTORC1受體，抑制了mTORC1的磷酸化[20]，而mTORC1表達(dá)下調(diào)又抑制了70S6K表達(dá)，通過滅活mTORC1/70S6K通路，抑制腫瘤細(xì)胞的體外增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)大花旋覆花素通過抑制mTORC1信號通路表達(dá)水平，上調(diào)促凋亡蛋白Bax和Caspase3，而同時下調(diào)抑凋亡蛋白Bcl2表達(dá)，發(fā)揮抑制Hep G2細(xì)胞體外增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，且均呈濃度依賴性特征。本研究為臨床應(yīng)用大花旋覆花素治療肝癌提供了一些實驗依據(jù)和理論支持。大花旋覆花素能否被開發(fā)用于治療人類腫瘤患者，尚需在細(xì)胞毒性和人體耐受性方面作進(jìn)一步研究。