文康 姚一帆 吳春艷 李霞 賈彩云

1 河南大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)院,河南 開封 475004;2抗體藥物開發(fā)技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室,河南 開封475004

膿毒癥(sepsis)被定義為由于宿主對感染反應(yīng)失調(diào)引起的威脅生命的多器官功能障礙[1]。目前尚無臨床應(yīng)用的特效治療藥物,膿毒癥的發(fā)病率仍在上升[2]。即使經(jīng)過治療,膿毒癥患者也會長期面臨嚴(yán)重功能性殘疾、心理和認(rèn)知障礙問題[3-4]。因此,通過建立動物模型來進(jìn)一步研究膿毒癥的致病機(jī)制并發(fā)現(xiàn)新的標(biāo)志物,使用生物標(biāo)志物來識別可能受益于更個性化關(guān)注的特定個體[5],從而采取精確治療措施,對預(yù)后是非常重要的。

為了解臨床膿毒癥的發(fā)病機(jī)制和發(fā)展有效的治療模式,有必要使用有效的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。目前已有多種動物模型用于膿毒癥的研究,常用的模型有靜脈內(nèi)毒素激發(fā)模型、活體生物腹腔注射模型、四肢膿腫模型[6-7],以及通過盲腸結(jié)扎和穿刺(cecal ligation and puncture,CLP)誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性微生物腹膜炎模型。本研究描述小鼠盲腸結(jié)扎穿刺(CLP)模型,該過程已被證明與人類臨床膿毒癥的性質(zhì)和過程非常相似。為驗(yàn)證其與臨床膿毒癥的一致性,本研究通過術(shù)后小鼠的體質(zhì)量變化、生存率、血常規(guī)、血生化檢測、血清炎性因子檢測、血液及腹腔液細(xì)菌培養(yǎng)、組織病理改變等指標(biāo)對模型進(jìn)行評價。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

6周齡雄性C57bl/6n小鼠,購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司,于普通潔凈級動物房飼養(yǎng)。動物實(shí)驗(yàn)方案由河南大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2 試劑盒器材

戊巴比妥鈉(北京華業(yè)寰宇化工有限公司);胰蛋白胨(OXOID),瓊脂(OXOID),化學(xué)試劑助劑(河南熱聯(lián)科技有限公司)。EDTAK2抗疑管(美國BD 公司);生化培養(yǎng)箱(Blue Pard);全自動血液細(xì)胞分析儀(MINFDRAY 公司,BC-5000Vet);血生化儀(IDEXX Vet Lab Station);ELLISA 試劑盒(鄭州騰飛爾生物科技有限公司);全自動包埋機(jī)(Thermo,美國);凍臺(Thermo,美國);石蠟切片機(jī)(Leica Biosystems Nussloch Gmb H,美國);無菌縫合線,縫合針,結(jié)扎線(寧波醫(yī)用縫針有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 CLP模型的建立

于接到小鼠當(dāng)天、術(shù)前每3 d、術(shù)后每12 h,稱小鼠體質(zhì)量并記錄。30只小鼠,隨機(jī)分為10只、20只兩組,分別作為Control(假手術(shù)組)和CLP 組。術(shù)前用0.02 g/m L 的戊巴比妥鈉(0.05 m L/只)腹腔注射麻醉。手術(shù)時小鼠仰臥位固定在手術(shù)臺上,腹部備皮,絡(luò)合碘消毒;在劍突下1 cm 中線處沿腹中線作長1～2 cm 縱切口,剪開腹膜暴露腹腔,用鑷子從左后側(cè)腹腔拉出盲腸,辨別腸系膜血管走向,用3-0號線于盲端1/2處結(jié)扎,注意避免損傷腸系膜血管;用8號針頭在結(jié)扎點(diǎn)遠(yuǎn)端中部不同位點(diǎn)貫穿腸壁穿孔2次;輕壓腸管,擠出適量腸內(nèi)容物,將腸管還納腹腔,逐層縫合關(guān)腹,消毒切口;于小鼠背部注射0.5 m L無菌生理鹽水補(bǔ)液。Control組需要相同操作暴露盲腸,但不進(jìn)行盲腸結(jié)扎和穿孔術(shù)。

1.2.2 血、腹腔載菌量檢測和腹腔巨噬細(xì)胞計數(shù)

于術(shù)后12 h、24 h,將小鼠進(jìn)行眼球放血采血。用5 m L注射器抽取無菌生理鹽水灌洗小鼠腹腔,收集腹腔灌洗液,3 000 r/min離心5 min,加1 m L PBS重懸。分別將100μL 采集的血液和腹腔重懸液均勻涂布在培養(yǎng)平板上,37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜,次日觀察菌落分布和數(shù)量并拍照。另取腹腔重懸液10μL,計數(shù)板計數(shù)腹腔巨噬細(xì)胞數(shù)量。

1.2.3 ELLIA 法血清IL-6、TNF-α檢測

按操作說明書制備標(biāo)準(zhǔn)品和試劑。洗滌緩沖液300μL/孔,洗板3次?？瞻卓酌靠准尤?00μL 標(biāo)準(zhǔn)/樣品稀釋液(R1)。每孔加入100μL 不同濃度(2 000,1 000,500,250,125,62.5,31.2 pg/m L)的標(biāo)準(zhǔn)品和血清(×10,×100稀釋),37 ℃孵育2 h,洗滌3次?？瞻卓字屑尤肷锼嘏悸?lián)抗體稀釋液(R2)100μL/孔,其他孔中加入100μL/孔生物偶聯(lián)抗體工作溶液,37 ℃孵育1 h,洗滌3次。在空白孔中加入鏈霉親和素稀釋液(R3),其他孔加入鏈霉親和素工作溶液100μL/孔,37℃孵育30 min,洗滌3次。添加底物TMB(四甲基聯(lián)苯胺)100μL/孔,37 ℃避光孵育15～20 min。加終止溶液50μL/孔,5 min內(nèi)酶標(biāo)儀450 nm 波長測光密度值。EXCEL生成標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算IL-6和TNF-α濃度。實(shí)驗(yàn)用不同批次小鼠重復(fù)3次。

1.2.4 血常規(guī)及生化指標(biāo)測定

分別于術(shù)后12 h、24 h眼球放血采血,室溫靜置2 h,7 000 r/min離心5 min;取血清,-80 ℃保存?zhèn)溆?。血?xì)胞儀進(jìn)行血細(xì)胞數(shù)檢測;血生化儀檢測血谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和肌酸激酶(CK)水平。

1.2.5 組織病理檢測

CLP術(shù)后48 h,頸椎脫臼法處死小鼠,取出小鼠肝、腎、肺和脾等臟器,PBS 洗滌,濾紙吸干表面水分,于4%(m/m)多聚甲醛溶液固定;經(jīng)組織脫水、石蠟包埋,組織切片;片厚3μm,HE 染色,在光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理變化情況并拍照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),兩組生存曲線比較用Log-rank(Mantel.Cox)檢驗(yàn),P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 C57bl/6n小鼠CLP模型建立及一般狀態(tài)觀察

CLP術(shù)后小鼠精神不佳,行動遲緩,飲食行為減少,背毛稀疏豎立。死亡小鼠解剖后可見腹腔充滿渾濁惡臭的滲出液,腸管多處粘連,結(jié)扎盲腸遠(yuǎn)端壞死,多臟器淤血腫脹(如圖1A所示)。肝臟腫大,顏色變暗(如圖1B所示);脾臟體積增大,尚有局部發(fā)黑現(xiàn)象(如圖1C所示)。

圖1 死亡小鼠解剖情況

2.2 手術(shù)后小鼠體質(zhì)量變化

如圖2A 所示,CLP組小鼠術(shù)后12 h體質(zhì)量開始下降,隨著時間延長下降明顯;Control組小鼠體質(zhì)量變化平穩(wěn)。截至術(shù)后108 h,CLP組與Control組小鼠體質(zhì)量比較差異顯著(圖2B,P<0.05)。

圖2 CLP術(shù)后小鼠體質(zhì)量變化情況

2.3 CLP術(shù)后小鼠生存曲線

CLP組小鼠術(shù)后12 h開始出現(xiàn)死亡,60%的小鼠于術(shù)后72 h內(nèi)死亡。觀察時長為1周,至觀察結(jié)束,共有12只死亡。如圖3所示,術(shù)后12,24,36,48,72 h 各個時間段的生存率分別為90%,65%,50%,45%,40%;截至觀察結(jié)束時間,只有30%左右的動物生存。Control組小鼠術(shù)后狀態(tài)平穩(wěn),生存率為100%(圖3,P<0.05)。

圖3 CLP術(shù)后小鼠的生存曲線

2.4 CLP手術(shù)后小鼠腹腔與血液載菌量、腹腔巨噬細(xì)胞的計數(shù)

分別取術(shù)后12 h、24 h小鼠的血液和腹腔灌洗液涂板,37℃過夜培養(yǎng),檢測結(jié)果如圖4所示:CLP組小鼠的腹腔灌洗液和血液中均檢測到細(xì)菌,Control組小鼠腹腔灌洗液和血液中未檢測到細(xì)菌。腹腔巨噬細(xì)胞計數(shù)結(jié)果如表1所示,CLP組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯升高,差異具有顯著性(P<0.001)。

表1 CLP術(shù)后小鼠腹腔巨噬細(xì)胞計數(shù)檢測結(jié)果

圖4 CLP術(shù)后血液和腹腔灌洗液載菌量

2.5 ELLIA法血清IL-6和TNF-α檢測結(jié)果

分別取12 h、24 h血清,按ELLISA 試劑盒說明書操作步驟進(jìn)行檢測,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算血清IL-6值和血清TNF-α值,結(jié)果如圖5所示:在12 h、24 h血清中,CLP組的IL-6水平分別為Control組的61倍、37倍(P<0.05),CLP組的TNF-α水平分別是Control組的4.69倍、7.9倍(P<0.05)。

圖5 CLP術(shù)后小鼠血清炎性介質(zhì)IL-6(A)和TNF-α(B)表達(dá)

2.6 CLP手術(shù)后血細(xì)胞計數(shù)與血生化檢查結(jié)果

LP 術(shù)后24 h 小鼠血常規(guī)檢測結(jié)果如表2 所示:白細(xì)胞總數(shù)(WBC)、淋巴細(xì)胞數(shù)(LYM)顯著下降,中性粒細(xì)胞(NEU)百分比和單核細(xì)胞(MON)百分比明顯升高。

表2 CLP術(shù)后小鼠24 h血常規(guī)結(jié)果

CLP術(shù)后12 h、24 h小鼠血生化檢測結(jié)果如表3所示:丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)和肌酸激酶(CK)均明顯升高,而且隨時間的延長升高更加明顯。

表3 CLP術(shù)后小鼠12 h和24 h血生化結(jié)果

2.7 CLP手術(shù)后組織病理檢查

CLP術(shù)后48 h,小鼠肝、腎、肺、脾組織病理學(xué)變化如圖6所示:小鼠肝臟組織內(nèi)可見肝細(xì)胞有點(diǎn)狀核固縮;腎臟近曲小管上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性受損;肺組織充血水腫;脾臟被膜呈破浪狀改變,小梁走向扭曲,淋巴小結(jié)結(jié)構(gòu)改變。

圖6 CLP術(shù)后48 h小鼠肝、腎、肺、脾組織病理學(xué)變化(×200)

3 討論

資料[8-10]顯示,腫瘤、大面積燒傷、極低出生體質(zhì)量新生兒、肝硬化、糖尿病和肺結(jié)核等疾病都可以合并感染引起膿毒癥。由于膿毒癥表現(xiàn)形式多樣,發(fā)病機(jī)制和疾病進(jìn)展的復(fù)雜性,相關(guān)的治療研究進(jìn)展緩慢。理想情況下,動物模型應(yīng)該模擬人類膿毒癥的速度和嚴(yán)重程度,以幫助了解藥物研究的進(jìn)展和臨床治療的發(fā)展。

本研究應(yīng)用盲腸結(jié)扎穿刺術(shù)建立膿毒癥模型,發(fā)現(xiàn)CLP術(shù)后小鼠出現(xiàn)寒顫、體質(zhì)量下降、毛發(fā)稀疏等膿毒癥的惡病質(zhì)狀態(tài)。此外,CLP術(shù)后小鼠的生存率明顯下降,72 h生存率約為40%。死亡小鼠解剖后可見腹腔充滿渾濁惡臭的滲出液,消化道多處壞死粘連,多臟器淤血腫脹等器官損傷特征。魏西軍[11]也報道了建模術(shù)后大鼠腹腔多臟器呈炎癥性特征性改變。同時,細(xì)胞內(nèi)的酶會釋放到體液中,CLP術(shù)后12 h和24 h的血常規(guī)結(jié)果顯示:ALT、AST、CK 的血清水平呈時間依賴性的升高。

血培養(yǎng)是診斷血流感染的金標(biāo)準(zhǔn)[12]。相對于Control組的陰性結(jié)果,CLP術(shù)后血液和腹腔灌洗液涂板培養(yǎng)結(jié)果顯示均有細(xì)菌生長,說明膿毒癥是由經(jīng)歷血液循環(huán)的病原微生物引起,并引起過度的全身炎癥反應(yīng)。為證明系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)在膿毒癥發(fā)生發(fā)展中的作用,本研究對CLP術(shù)后小鼠血清炎性因子IL-6和TNF-α的水平進(jìn)行了檢測,結(jié)果顯示:CLP術(shù)后小鼠血清中有大量炎性因子,而且各因子的血清水平隨時間存在動態(tài)變化。為了進(jìn)一步驗(yàn)證膿毒癥發(fā)生后機(jī)體各臟器生理功能受損的物質(zhì)基礎(chǔ),對手術(shù)后48 h內(nèi)的肝、腎、肺和脾等器官進(jìn)行了病理學(xué)檢測,HE染色結(jié)果顯示:CLP術(shù)后肝臟的肝細(xì)胞有點(diǎn)狀核固縮現(xiàn)象;肺臟出現(xiàn)充血水腫;腎臟近曲小管上皮細(xì)胞膜損傷嚴(yán)重;脾被膜破浪樣改變,小梁紊亂,脾淋巴結(jié)變形。說明膿毒癥是機(jī)體重要器官損傷,淋巴器官功能受損,不能行使正常的免疫防御功能。

綜上所述,CLP小鼠膿毒癥模型建造成功,穩(wěn)定可重復(fù),可以作為研究人類膿毒癥發(fā)病機(jī)制、尋找檢測和治療的新靶點(diǎn),以及驗(yàn)證藥物療效的理想模型。