姚文豪， 陳志英， 王 杰， 徐 魏， 李文陽

(安徽科技學院 農(nóng)學院，安徽 鳳陽 233100)

玉米是世界上重要的糧食作物之一,也是我國三大主要糧食作物之一,對保證國家糧食安全有著重要的作用[1-2]。與此同時,我國對于玉米的需求量不斷增長，消費量從2010/2011年度的1.92億t增長至2019/2020年度的2.96億t,增長54%,年均增長5.1%。我國對玉米種子的需求量不斷增加,貯藏問題顯得額外重要[3-4]。種子從收獲后即開始發(fā)生劣變和老化,老化種子表現(xiàn)為發(fā)芽力和活力下降，細胞膜損傷，生理特性改變，遺傳完整性變差,最終失去生命力和種用價值[5-6]。高活力的種子對玉米質(zhì)量與產(chǎn)量有著很大的影響[7]。確保玉米種子貯藏后的活力至關重要，溫度是決定玉米貯藏活力大小的一個關鍵外部因素,脂質(zhì)過氧化被公認是導致種子陳化變質(zhì)的最主要因素,而脂肪氧化酶是脂質(zhì)降解的關鍵酶[8],SOD、POD和CAT是植物體內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)[9],低溫貯藏下的SOD、POD和CAT活性高于常溫貯藏下的酶活性,與室溫貯藏相比低溫貯藏有利于維持種子活力[10]。除此之外,品種本身的生理特性也是影響種子活力的另一重要因素[11-12]。常溫條件下,玉米種子種胚大,呼吸旺盛,同時胚部脂肪含量高,容易酸敗,與常溫貯藏相比,低溫貯藏下種子代謝弱,消耗貯藏物質(zhì)少,有利于貯藏物質(zhì)的積累,有利于種子活力的保持[10,13]。

因此,分析玉米種子在低溫貯藏環(huán)境中的內(nèi)在變化與常溫環(huán)境中的區(qū)別,對探究玉米種子低溫貯藏的內(nèi)在機理變化,提高貯藏種子的活力有著重要的意義。隨著轉(zhuǎn)錄組測序技術在農(nóng)業(yè)科學上的不斷發(fā)展[14]，可以對玉米的轉(zhuǎn)錄組序列結(jié)構進行解釋和功能分析,從而揭示玉米植株內(nèi)部的生物抗性[15]。本試驗通過計算常溫和低溫貯藏下玉米種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)來比較兩種不同貯藏溫度下種子活力大小,并通過選擇常溫和低溫貯藏下的玉米種子為材料，利用RNA-sep轉(zhuǎn)錄組測序方法,篩選出差異基因,通過KOG注釋、GO分類、KEGG注釋分析,從分子水平上為玉米低溫和常溫貯藏時內(nèi)部機理變化所產(chǎn)生的差異提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設計

以蠡玉166為供試材料。將種子于2020年6-8月分別放置于室溫貯藏(對照,Control)和低溫(0～4 ℃)貯藏(Low temperature condition)。將不同溫度貯藏條件下種子進行標準發(fā)芽試驗,人工氣候箱中25 ℃,RH95%,其中12 h光照，12 h黑暗。3次重復,每重復50粒,濕沙床在消毒后進行標準發(fā)芽實驗,3 d后計算發(fā)芽勢,7 d后計算出發(fā)芽率并進一步計算出發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)。

發(fā)芽勢=(第3天種子發(fā)芽數(shù)/試驗種子總數(shù))×100%;

發(fā)芽率=(第7天種子發(fā)芽數(shù)/試驗種子總數(shù))×100%;

發(fā)芽指數(shù)(GI)=∑(Gt/Dt);

活力指數(shù)(VI)=GI×S;

式中,Gt為t時間種子發(fā)芽數(shù),Dt為相應發(fā)芽時間;S為第7天幼苗長度。

取7 d后的幼苗,用液氮將冷凍管中實驗材料急速冷凍,保存于-80 ℃下。試驗樣品委托上海生工生物工程公司進行檢測。

1.2 測定項目及方法

使用FastQC 0.11.2軟件對各個樣本測序的原始數(shù)據(jù)進行質(zhì)量評估;使用StringTie-1.3.3b軟件對每個樣本進行組裝;使用DEGseq 1.26.0軟件進行組間差異表達分析[16]。設置參數(shù):qValue<0.05,且差異倍數(shù)|FoldChange|>2。采用topGO 2.24.0進行GO富集分析。使用ClusterProfiler 3.0.5進行KEGG通路和KOG分類富集分析?；诨蚬δ芨患治鼋Y(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同貯藏溫度對玉米種子活力的影響

由表1可知,低溫貯藏種子在發(fā)芽勢、發(fā)芽率、活力指數(shù)分別高出常溫種子8%、12%、56.60%,說明低溫條件更有利于種子活力的保持。

表1 不同貯藏條件下玉米種子活力的變化

2.2 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量分析

由表2可以看出,2處理各重復樣品測序Q20 Bases Ratio>98%,堿基百分比Q30 Bases Ratio>94%,52.74%≤GC Bases Ratio≤56.25%,證明數(shù)據(jù)可行性高,可作為后續(xù)的分析依據(jù)。

表2 樣本QC數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2.3 差異表達基因的篩選

為了檢測基因表達在貯藏條件下對玉米種子發(fā)芽率降低后幼苗的影響,設置參數(shù):qValue<0.05,且差異倍數(shù)|FoldChange|>2,作為顯著差異的表達基因。低溫貯藏的玉米種子與自然貯藏狀態(tài)下的玉米種子處理間篩選出差異基因4個,其中,上調(diào)基因3個,下調(diào)基因1個(圖1)。

圖1 不同貯藏方式差異表達基因比較

2.4 差異表達基因的KOG注釋

由圖2可知,低溫貯藏的種子與自然貯藏狀態(tài)下的種子處理在KOG注釋分析中,有19 656個KOG功能得到注釋,無富集化表達功能,低溫與常溫對照無明顯差異。

圖2 差異表達基因KOG功能分類圖

2.5 差異表達基因的GO分類

如圖3所示，在GO分析中低溫貯藏的種子與自然貯藏狀態(tài)下的種子處理之間,在生物過程中應激反應、代謝過程、細胞過程3個亞類存在差異,差異基因各1個;細胞過程中細胞、細胞部分、細胞器3個亞類存在差異,差異基因各1個;分子功能中結(jié)合成分存在差異,差異基因1個。

圖3 差異基因GO注釋分類柱狀圖

2.6 差異表達基因KEGG注釋分析

如圖4顯示,在KEGG注釋分析中有機系統(tǒng)的環(huán)境適應組分存在顯著差異,包含差異基因4個;其它組分均未發(fā)現(xiàn)顯著差異。低溫貯藏的LY166種子與自然貯藏狀態(tài)下的LY166種子處理的KEGG的通路分析表明植物病原菌互作P<0.01達到極顯著水平,表明貯藏條件影響植物病原菌互作過程,降低相關基因表達量,最終不利于種子萌發(fā)后幼苗的生長(表3)。

圖4 差異基因KEGG注釋分類柱狀圖

表3 不同貯藏條件下玉米種子差異基因KEGG通路分析

3 結(jié)論與討論

與常溫對照相比低溫貯藏更有利于維持種子活力。發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)等指標一直作為眾多研究者探討種子活力和壽命的重要指標[17-18]。轉(zhuǎn)錄組測序技術的應用很大程度上推動了植物分子水平方面的研究[19]。RNA-Sep是一種在轉(zhuǎn)錄水平上更為精確的測定分析方法，其通量高、分辨率高、靈敏度高且不受物種限制[20]。本研究對自然貯藏和低溫貯藏玉米種子,萌發(fā)幼苗進行芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)的計算比較以及RNA-Sep測序分析。

試驗研究結(jié)果表明,低溫貯藏下的玉米種子在發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)上顯著高于常溫對照種子,發(fā)芽勢、發(fā)芽率、活力指數(shù)分別高出8%、12%、56.60%。低溫貯藏有利于保持玉米種子中SOD、POD和CAT酶的活性,有利于抑制細胞內(nèi)所發(fā)生的脂質(zhì)過氧化作用和清除過量累計自由基,維持種子活力[10,21-22]。RNA-Sep測序分析結(jié)果表明,玉米轉(zhuǎn)錄組共獲得4個差異基因,3個上調(diào)基因,1個下調(diào)基因。在KEGG代謝途徑分析中,植物-病原互作相關代謝途徑表達明顯上調(diào)。王藝璇等[23]在番茄低溫響應WRKY轉(zhuǎn)錄因子的鑒定和分析中指出低溫脅迫能夠誘導水楊酸(SA)活性氧(ROS)和茉莉酸(JA)的產(chǎn)生。Kasote等[24]在西瓜枯萎病敏感和抗性植株在植物與病原菌互作中激素和代謝產(chǎn)物的反應中研究表明,植株在接種尖孢鐮刀菌(FON)后第8天,植株中水楊酸(SA)水平顯著高于對照植株。說明在低溫貯藏下有利于植株體內(nèi)有機酸的生成,提高植株與病原菌的互作能力。

嘌呤代謝途徑明顯下調(diào)。Fujihara等[25]發(fā)現(xiàn)植物衰老和種子發(fā)芽常有大量尿酸的積累。表明低溫貯藏條件下的種子尿酸等物質(zhì)的基因表達受到抑制,可以減緩種子衰老,抑制發(fā)芽,進一步從分子水平上為玉米種子低溫貯藏和常溫貯藏時內(nèi)部機理變化所產(chǎn)生的差異提供參考。