張志鵬，孫旺吾，劉羿羿，周歡敏* (.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學 生命科學院 內(nèi)蒙古自治區(qū)生物制造重點實驗室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 0008；.山東省萊西市第一中學，山東 萊西 66000)

與牛[1]、羊[2]等家畜相比，馬的胚胎移植技術研究起步較晚。1972年，日本最先成功完成馬胚胎的收集和移植，是馬胚胎移植技術研究成功的先驅(qū)[3]。1990年，非手術胚胎移植技術研究成功，并進行了規(guī)模化的生產(chǎn)[4]。2015年，國際胚胎移植學會報告稱[5]，全球共有20 924匹馬接受了胚胎移植。我國對馬胚胎移植技術的研究較少，1982年，馬玉斌等[6]通過非手術法采集到6枚胚胎，胚胎移植成功率為33.3%(2/6)。2005年，新疆畜牧研究院[7]報道了馬非手術法胚胎移植技術的研究，沖胚率為58.3%，移植成功率為30.8%(4/13)。2012年，青島農(nóng)業(yè)大學[8]利用胚胎移植技術繁育國外品種馬，生產(chǎn)了6匹馬駒。

我國現(xiàn)代馬術用馬的匱乏，成為我國馬產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要制約因素[9]。胚胎移植是馬繁育的一種輔助生殖技術，從有價值的供體母馬身上采集可繁殖胚胎，移植到受體母馬體內(nèi)，使受體母馬懷孕至生產(chǎn)馬駒，可以克服距離、競技比賽、生殖健康和時間的限制，使供體母馬在1年內(nèi)產(chǎn)下多個小馬駒[10]。因此，本研究針對國內(nèi)優(yōu)良現(xiàn)代馬術用馬市場需求，開展馬胚胎移植技術體系的研究，探討母馬發(fā)情和排卵鑒定與調(diào)控、公馬的采精與人工授精、非手術法胚胎采集與鑒定、非手術法胚胎移植、孕馬的妊娠診斷等技術環(huán)節(jié)，建立了馬胚胎移植技術體系，獲得穩(wěn)定的人工授精、胚胎移植成功率，在提升我國的馬繁育技術的同時，可滿足國內(nèi)市場對現(xiàn)代馬術用馬需求。

1 材料與方法

1.1 試驗材料青島海氏海諾集團萊河大自然農(nóng)場有限公司(以下簡稱海諾農(nóng)場)內(nèi)的3匹公馬(漢諾威馬、塞拉-法蘭西馬和荷蘭溫血馬各1匹)、12匹供體母馬(漢諾威馬5匹、塞拉-法蘭西馬4匹和荷蘭溫血馬3匹)和81匹國內(nèi)品種馬(受體母馬)。

1.2 母馬發(fā)情調(diào)控母馬排卵后第5 天，連續(xù)2 d肌肉注射0.2 mg PGF2α或1 500 IU PMSG，每組30匹母馬，在注射激素后2，9 d(即母馬排卵后第7，14 天)檢測母馬發(fā)情情況。

1.3 母馬排卵調(diào)控母馬卵泡直徑≥30 mm時，靜脈注射1 500 IU hCG或肌肉注射300 IU FSH+200 IU LH，每組19匹母馬，每12 h檢測母馬的排卵情況。

1.4 人工授精牽引公馬爬跨假臺馬的方法進行采精后，進行精液的品質(zhì)檢測，然后使用無菌宮內(nèi)輸精管進行人工輸精，選取子宮、子宮角和自然交配3種不同的授精方式，探討母馬受孕率的情況。每組10匹母馬，下午15:00至16:00進行不同方式的輸精試驗。

1.5 非手術法采集胚胎本試驗選用“點滴式”進行沖胚，“Y”型管帶氣囊一端進入母馬子宮，另一端連接沖胚液和集胚皿，每次向子宮灌注1 L 沖胚液，結(jié)束胚胎采集后，將胚胎過濾器放在體視顯微鏡下?lián)炫?。本試驗選擇乳酸鈉林格注射液和EURO FLUSH沖胚液2種不同的液體作為沖胚液，探討不同的沖胚液的采集效率。

1.6 非手術法胚胎移植本研究選取3種胚胎保存液，探討不同的胚胎保存液對胚胎移植成功率的影響。試驗1組為實驗室制備胚胎保存液(HN-EHM)，包含M199、10.0% FBS、0.01 UI/mL FSH、0.01 UI/mL LH、200 μg/L IGF-I、0.05 g/LL-谷氨酰胺、1.0 %雙抗；試驗2組為IMV胚胎保存液；試驗3組為乳酸鈉林格注射液。3個試驗組分別選用6孔培養(yǎng)皿每孔放入1 mL胚胎保存液，胚胎清洗5遍后進行胚胎裝管，最后將胚胎移入母馬子宮中。

1.7 妊娠診斷本研究選取B超檢查法診斷母馬的妊娠情況，母馬授精后9，12，14，17，27，45 d，利用B超儀對孕馬進行妊娠診斷。

2 結(jié)果

2.1 母馬的排卵檢查結(jié)果B超檢測卵泡發(fā)育的影像，如圖1A所示，排卵后2 d，卵泡直徑較小(f)，存在明顯的黃體。排卵后3～10 d，卵泡的直徑波動不大(圖1B)，仍能發(fā)現(xiàn)明顯的黃體(CL)。到14 d，黃體明顯變小甚至消失(圖1C)，卵泡的直徑變大，出現(xiàn)發(fā)情現(xiàn)象。18～20 d(圖1D)，黃體完全溶解，卵泡生長到(42.3±3.6) mm。即將發(fā)生排卵的卵泡(圖1E)，卵泡直徑增長到45.0 mm左右，卵泡壁變薄，但形狀仍然處于規(guī)則狀態(tài)。圖1F顯示正在或即將發(fā)生排卵的卵泡，直徑變小，卵泡變形。

A.排卵后2 d卵泡圖像；B.排卵后3～10 d卵泡圖像；C.排卵后14 d卵泡圖像；D.排卵后18～20 d卵泡圖像；E.即將排卵卵泡的圖像；F.正在排卵的卵泡。CL.卵巢黃體；f.卵巢卵泡。超聲波B超儀(KX5000)探頭為7.5 MHz L40線陣寬頻探頭(頻率范圍6.0～9.0 MHz，中心頻率7.5 MHz)圖1 卵泡發(fā)育過程和直徑變化

2.2 不同激素誘導母馬發(fā)情的結(jié)果本試驗對試驗母馬注射不同種類的激素，處理后2 d(即母馬排卵后7 d)，肌肉注射0.2 mg PGF2α組、肌肉注射1 500 IU PMSG組和對照組(自然發(fā)情)的發(fā)情比例分別是63.2%，47.2%，0.0%(自然發(fā)情試驗組沒有母馬發(fā)情)，3個試驗組差異顯著(P<0.05)。3個試驗組注射相應的激素后9 d(即母馬排卵后14 d)，檢測3組的發(fā)情比例分別是94.7%，89.2%,78.9%，PGF2α試驗組顯著高于對照組(P<0.05)。PGF2α能夠有效的誘導母馬發(fā)情，漢諾威馬、賽拉-法蘭西馬、荷蘭溫血馬和國內(nèi)品種馬(受體馬)的發(fā)情周期分別由(21.1±2.8)，(21.9±2.2)，(21.3±3.3),(21.6±2.4) d，縮短至(11.7±3.1)，(12.2±2.8)，(11.5±1.9),(12.7±2.3) d。

2.3 不同激素調(diào)控馬排卵的比例B超測得卵泡直徑≥30 mm時，靜脈注射1 500 IU hCG、肌肉注射300 IU FSH + 200 IU LH組和對照組(自然排卵)，如圖2A、B所示，48 h內(nèi)，排卵比例分別是84.2%(16/19)，31.6%(6/19)，15.8%(3/19)，三者差異顯著(P<0.05)。60，72 h的排卵比例如圖2C、D所示，3個試驗組馬的排卵比例分別是10.5%(2/19)，42.1%(8/19)，21.1%(4/19)和5.3%(1/19)，21.1%(4/19)，36.8%(7/19)，3個試驗組馬排卵比例差異顯著(P<0.05)。本試驗可以得出，hCG能夠有效調(diào)節(jié)母馬的排卵，84.2%的母馬在36～48 h內(nèi)排卵。

A.36 h母馬排卵比例；B.48 h母馬排卵比例；C.60 h母馬排卵比例；D.72 h母馬排卵比例圖2 卵泡排卵調(diào)控的結(jié)果

2.4 不同輸精方式對母馬受孕率的影響本試驗選取不同的輸精方式，探討母馬的受孕率情況，結(jié)果如圖3A所示，子宮角和子宮輸精的母馬受孕率分別是95.1%(39/41)和91.9%(34/37)，顯著高于自然交配的56.2%(9/16)(P<0.05)。3個試驗組的情期受胎率分別是85.4%(36/41)，78.4%(29/37)，25.0%(4/16)，差異顯著(P<0.05)。3種不同的繁育方式所用的輸精次數(shù)沒有顯著性差異(圖3B)，分別為(2.3±0.6)，(1.7±0.6)，(2.8±0.7)次(P>0.05)。與傳統(tǒng)的輸精方式相比，本試驗通過子宮角輸精的精液使用量為(9.3±1.1) mL(圖3C)，顯著低于傳統(tǒng)的子宮輸精量(18.4±2.5) mL(P<0.05)。子宮輸精和子宮角輸精孕馬流產(chǎn)率不高(圖3D)，分別是2.9%(1/34)和2.6%(1/39)，低于自然交配的22.2%(2/9)。

A.不同輸精方式母馬受孕率；B.不同輸精方式輸精次數(shù)；C.不同輸精方式精液量；D.不同輸精方式孕馬流產(chǎn)率圖3 不同輸精方式對比

2.5 不同沖胚液對胚胎收集效率的影響乳酸鈉林格注射液和EURO FLUSH 沖胚液的采集胚胎成功率分別是71.8%(46/64)和70.0%(21/30)，兩者差異不顯著(P>0.05)。但是，前者的價格(61.6元/次)比后者(480.0元/次)便宜，本試驗選取乳酸鈉林格作為沖胚液。本試驗共進行92匹次胚胎采集(7～8 d)應用研究，成功采集胚胎67匹次，成功率為72.8%，獲得75枚胚胎。如圖4A所示，4月份有5匹次非手術法采集胚胎試驗，數(shù)量最少，6月份有23匹次采集胚胎試驗，數(shù)量最多。每個月份采集胚胎的成功率也不同，如圖4B所示，4，5，6月份采集胚胎的成功率超過80.0%，成功率最高的為5月份，達到88.9%(16/18)，而7，8，10月份成功率較低，分別為53.8%(7/13)，54.8%(6/11)，42.9%(3/7)。

A.受體母馬不同月份沖胚次數(shù)；B.不同月份沖胚成功率;C.不同品種供體母馬的沖胚次數(shù)圖4 沖胚次數(shù)

2.6 胚胎移植的成功率本試驗通過非手術法進行胚胎采集，共獲得75枚囊胚胚胎(8 d)，其中A級胚64枚(圖5A)，胚胎的大小適中，透明度優(yōu)良，細胞緊密排列。B級胚7枚(圖5B)，胚胎發(fā)育過快或過緩。C級胚4枚(圖5C)，胚胎發(fā)育階段與胚齡不一致，細胞結(jié)構(gòu)松散，色澤過暗或過深。自制胚胎保存液(HN-EHM)試驗組進行10枚胚胎的移植，8匹受體馬受孕，胚胎移植成功率為80.0%。IMV胚胎保存液試驗組進行18枚胚胎的移植，15匹受體母馬受孕，胚胎移植成功率為83.3%。乳酸鈉林格注射液試驗組進行8枚胚胎的移植，6匹受體母馬受孕，胚胎移植成功率為75.0%，低于其他2組的成功率。本試驗進行17匹次早期胚胎(5～6 d)的采集試驗，成功沖胚12匹次，成功率為70.6%，獲得12枚早期囊胚(圖5D)，進行11匹次胚胎移植試驗，10匹受體母馬受孕，移植成功率為90.9%。

A.8 d非手術法胚胎采集A級胚胎圖像；B.8 d B級胚胎圖像；C.8 d C級胚胎圖像；D.6 d胚胎圖像圖5 胚胎的質(zhì)量檢測 (×100)

2.7 孕馬妊娠診斷的結(jié)果B超能夠準確檢查孕馬的胚胎發(fā)情情況，在母馬受孕后9 d(圖6A)精確檢查到子宮中胚胎的位置與形狀。胚胎發(fā)育到11 d時候較小(圖6B)，約黃豆粒大小，規(guī)則圓形。發(fā)育到17 d胚胎呈現(xiàn)三角形狀態(tài)(圖6D)，27 d開始出現(xiàn)心跳(圖6E)，45 d胎兒基本成型(圖6F)。

A.9 d胚胎發(fā)育圖像；B.11 d 胚胎發(fā)育圖像；C.14 d 胚胎發(fā)育圖像；D.17 d 胚胎發(fā)育圖像；E.27 d 胚胎發(fā)育圖像；F.45 d 胚胎發(fā)育圖像。超聲波B超儀(KX5000)探頭為7.5 MHz L40線陣寬頻探頭(頻率范圍6.0～9.0 MHz，中心頻率7.5 MHz)圖6 胚胎發(fā)育B超檢查圖像

3 討論

母馬的發(fā)情周期平均為21 d(18～25 d)，發(fā)情期持續(xù)5～7 d，要比其他家畜長得多[11]。一般情況下，馬的發(fā)情與卵泡生長呈現(xiàn)相關性[12]。有些特殊情況，馬處于間情期，卵巢中仍然存有直徑較大的卵泡，約25～30 mm；發(fā)情期，卵泡直徑較小，約15～20 mm[13]。母馬發(fā)情與卵泡生長的時間可能發(fā)生“錯位”現(xiàn)象，這就導致了以發(fā)情判斷為依據(jù)的自然交配的效率低，無法提高成功率，僅通過判斷母馬發(fā)情狀態(tài)進行授精，忽略了卵泡發(fā)育狀態(tài)的重要因素，導致母馬受孕率較低[14]。

超數(shù)排卵可以促使動物排出多個卵母細胞，通過人為提高體內(nèi)外源性促卵泡激素的水平，促使多個有腔卵泡發(fā)育、成熟和排卵[15]。目前對馬超數(shù)排卵的研究甚少，僅有個別的試驗使用馬垂體提取促性腺激素，主要是FSH和LH促進馬排卵，并已被證明增加了處理母馬的排卵次數(shù)[16]。影響馬超數(shù)排卵的因素主要有兩大類：一類是母馬自身因素，包括個體和遺傳的差異、生理和營養(yǎng)狀態(tài)、季節(jié)及環(huán)境因素對母馬的影響[17]；另一類是藥物因素，包括激素的種類、給藥途徑、劑量和頻率等。卵巢狀態(tài)是母馬主要的自身因素，GUILBAULT 等[18]的研究表明，有優(yōu)勢卵泡存在的前提下，用促性腺激素超排，會降低排卵數(shù)量，導致胚胎減少。超數(shù)排卵過程中，促卵泡素使用量逐漸降低，與此同時，體內(nèi)來源的促卵泡素的分泌量降低，由于低量的促卵泡素，后期的卵泡不能發(fā)育，導致閉鎖[19]。在超數(shù)排卵過程中，優(yōu)勢卵泡可能最先排卵，進而產(chǎn)生黃體，分泌孕激素抑制發(fā)情，導致了發(fā)情和排卵周期性結(jié)束[20]。

授精時機的掌握是人工授精成功的關鍵，與常規(guī)輸精相比，深部輸精且在排卵側(cè)子宮角輸精10 mL能夠提高馬的受胎率。其他動物的輸精已經(jīng)采用深部輸精方式，在豬的研究中，深部輸精80 mL提高母豬受胎率和分娩率分別為3.23%和3.31%，總產(chǎn)仔豬數(shù)提高了0.27頭，顯著提高出生窩重，降低斷奶窩重，但對斷奶仔豬數(shù)及哺乳成活率影響不顯著[21]。在羊的研究中，子宮角輸精的受孕率顯著高于頸口輸精的受孕率，前者的成功率為91.3%，生產(chǎn)率為136.8%(羊是多胎動物)，后者的成功率為36.4%，生產(chǎn)率為100.0%[22]。

目前，沖胚的方式主要有2種，一種是“回流式”，即采胚導管呈現(xiàn)為直筒形式，帶有氣球一段進入母馬子宮，另一端連接裝有沖胚液的瓶子，沖胚過程中，回流液直接進入原來裝有沖胚液的瓶子中[23]。第二種是本試驗使用的方法 “點滴式”沖胚，兩者的沖胚成功率沒有差異，都在70.0%～85.0% 之間，“回流式”沖胚法主要在德國、比利時等國家應用，“點滴式”沖胚法主要在法國、美國等國家應用[24]。人工授精、胚胎移植試驗中，每次不可能保證母馬全部受孕，利用B超進行妊娠檢測能夠更快、更精準的了解馬受孕情況。在未孕情況下，本研究要檢測母馬子宮是否存有液體，有無炎癥等情況，以便進行子宮的沖洗工作[25]。

本研究提出一種有效的調(diào)控馬同期發(fā)情的方法，對馬的發(fā)情、排卵進行有效的調(diào)控，突破馬子宮角人工授精技術，提高了馬的人工授精成功率，完善馬非手術法沖胚、胚胎移植技術體系，首次進行桑椹胚的采集與移植技術研究。本研究將與合作單位共同打造國內(nèi)知名的馬繁育、培育、技術研發(fā)基地，培育馬胚胎移植的核心產(chǎn)業(yè)，推動馬胚胎移植技術的市場化、產(chǎn)業(yè)化，加快現(xiàn)代育馬產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。