孔繼川，李 楊，周景春

(1 河南理工大學(xué)，河南 焦作 454000； 2 北京本草方源藥業(yè)集團(tuán)有限公司,北京 102600)

在藥學(xué)高等教育中如何培養(yǎng)動(dòng)手能力強(qiáng)，專業(yè)素質(zhì)高的藥學(xué)人才是實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革研究的重點(diǎn)課題，也是我國藥學(xué)人才培養(yǎng)的重要目標(biāo)[1-2]。藥學(xué)實(shí)驗(yàn)是培養(yǎng)學(xué)生實(shí)踐能力和創(chuàng)新能力的重要環(huán)節(jié)。目前藥學(xué)高等教育中藥學(xué)實(shí)驗(yàn)課程內(nèi)容相對陳舊，驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)較多，不能滿足藥學(xué)創(chuàng)新型和復(fù)合型應(yīng)用人才培養(yǎng)要求，亟須對藥學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)進(jìn)行改革與創(chuàng)新。2018年教育部提出“建設(shè)中國金課”，即課程要具備高階性、創(chuàng)新性和挑戰(zhàn)度?！案唠A性”，是指知識、能力與素質(zhì)的有機(jī)融合；“創(chuàng)新性”，指課程內(nèi)容有前瞻性和時(shí)代性，教學(xué)形式呈現(xiàn)先進(jìn)性和互動(dòng)性，學(xué)習(xí)結(jié)果具有探究性和個(gè)性化；“挑戰(zhàn)度”，指課程有一定難度，需要跳一跳才能夠得著。按照“兩性一度”金課標(biāo)準(zhǔn)，探索構(gòu)建設(shè)計(jì)性、與生產(chǎn)實(shí)踐和專業(yè)課程知識融合的探究性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，讓學(xué)生依據(jù)企業(yè)見習(xí)和文獻(xiàn)調(diào)研并利用所學(xué)藥學(xué)專業(yè)知識進(jìn)行實(shí)驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)和準(zhǔn)備，提升藥學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)的創(chuàng)新性和挑戰(zhàn)度，培養(yǎng)學(xué)生創(chuàng)新思維和解決問題的能力。

中醫(yī)藥作為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)重要組成部分在疫情防控和諸多疾病治療中發(fā)揮了重要作用[3]，伴隨著中藥分離提取技術(shù)不斷進(jìn)步和中藥有效成分的藥用機(jī)制的深入研究，中藥活性成分制劑在諸多疾病治療中的作用越來越受到科研工作者的關(guān)注[3-4]。金銀花為常用中藥材，具有抗病毒，降血脂，降血糖等功能[5]。研究發(fā)現(xiàn)，金銀花是2019-nCoV肺炎的潛在治療藥物[6]。綠原酸是金銀花中主要成分，具有抗菌，抗氧化，抗病毒，抗腫瘤等多種藥理活性，已成為中藥活性物質(zhì)研究的熱點(diǎn)之一[7-8]。目前金銀花中綠原酸的提取尚無固定工業(yè)化提取工藝[9-10]。文章以中藥材金銀花中綠原酸提取工藝為例，探索設(shè)計(jì)藥學(xué)探究性綜合實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)學(xué)生實(shí)踐創(chuàng)新能力，為藥學(xué)實(shí)踐性“金課”建設(shè)提供有益的實(shí)踐教學(xué)案例。

1 實(shí)驗(yàn)的技術(shù)背景和設(shè)置思路

金銀花中綠原酸提取方法有水提法、醇提法、索氏提取法、超聲提取法等。 水提法經(jīng)濟(jì)易行，但提取率低[4]，且水溶性雜質(zhì)多，不易純化。醇提法用乙醇做溶媒，提取液雜質(zhì)少，不易變質(zhì)，便于后續(xù)加工，是綠原酸提取的常用方法。超聲輔助提取法利用超聲波的空化作用釋放金銀花中的綠原酸，提取效率高且不易破壞活性物質(zhì)。索氏提取法利用溶媒的蒸發(fā)冷凝回流多次溶解萃取物質(zhì)有效成分，溶媒用量少，雜質(zhì)含量少。文章設(shè)計(jì)以金銀花為原料，分別采用水提法、超聲提取法和索氏提取法對金銀花中綠原酸進(jìn)行提取，并以紫外可見分光光度法對其含量進(jìn)行測定，以期找到一種方便易行，適合工業(yè)化生產(chǎn)綠原酸提取工藝，使實(shí)驗(yàn)研究反饋于生產(chǎn)實(shí)踐，培養(yǎng)學(xué)生學(xué)以致用服務(wù)社會的責(zé)任擔(dān)當(dāng)。

影響綠原酸提取工藝的因素有溫度、時(shí)間、溶媒和料液比等。為便于比較各種提取方法的提取效率，實(shí)驗(yàn)采用固定料液比、提取時(shí)間、提取溫度和循環(huán)次數(shù)，考察不同提取方法的提取效率。由綠原酸結(jié)構(gòu)式(圖1)可知綠原酸是一種酚酸類化合物，由于具有羧基和鄰二酚羥基的結(jié)構(gòu)，其含較多親水基團(tuán)，所以提取溶媒可作為考察綠原酸提取效率重要因素，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道索氏提取法提取效率相對較優(yōu)[11]，因此實(shí)驗(yàn)比較水提法、超聲提取法和索氏提取，并重點(diǎn)考察溶劑極性對索氏提取法提取效率的影響，引導(dǎo)訓(xùn)練學(xué)生分析和解決問題能力的同時(shí)，以期實(shí)驗(yàn)結(jié)果能為綠原酸的工廠化生產(chǎn)提供理論支撐。在綠原酸含量測試方法選擇上引導(dǎo)學(xué)生依據(jù)綠原酸結(jié)構(gòu)分析綠原酸可產(chǎn)生紫外吸收且極性大，可用高效液相色譜法和紫外分光光度法測定綠原酸含量。高效液相色譜法準(zhǔn)確度高但操作繁瑣，耗時(shí)長，而紫外分光光度法操作簡便，在藥學(xué)專業(yè)實(shí)驗(yàn)中也是最常用的定量測試方法，在有限的學(xué)時(shí)內(nèi)也便于完成操作，因此實(shí)驗(yàn)采用紫外可見分光光度法對綠原酸進(jìn)行定量。

圖1 綠原酸結(jié)構(gòu)式Fig.1 Molecular structure of Chlorogenic acid

2 實(shí)驗(yàn)的具體內(nèi)容

2.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/h3>

通過探索性實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)打破學(xué)生原有驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)固有思維模式，拓展學(xué)生對中藥提取工藝的認(rèn)識，熟悉設(shè)定提取工藝考察參數(shù)和建立定量鑒別方法的依據(jù)，掌握提取實(shí)驗(yàn)所用儀器的操作方法，了解實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)的基本思路，培養(yǎng)學(xué)生的科研思維技能。要求掌握實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理方法，并能依據(jù)工業(yè)生產(chǎn)需求得出切合實(shí)際的結(jié)論，培養(yǎng)學(xué)生實(shí)事求是的科研作風(fēng)。

2.2 實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)

2.2.1 綠原酸的提取工藝

(1)水提取法：稱取金銀花粉末12.00 g，加入200 mL蒸餾水，在錐形瓶中溶解，置于90 ℃下1 h，抽濾，將濾渣加入200 mL蒸餾水重復(fù)上述步驟，合并濾液后離心(3000 r/min， 11 min)，清液減壓蒸餾(40 ℃)濃縮至30 mL，置于4 ℃冰箱中待用；

(2)超聲提取法：稱取金銀花粉末12.00 g，加入200 mL蒸餾水，在90 ℃下超聲1 h，抽濾，濾渣加入200 mL蒸餾水后重復(fù)上述步驟，合并濾液后離心(3000 r/min，11 min)，清液減壓蒸餾(40 ℃)濃縮至30 mL，置于4 ℃冰箱中待用；

(3)索氏提取法：稱取金銀花粉末12.00 g置于索氏提取器中，分別用80%甲醇，無水乙醇，乙酸乙酯各100 mL進(jìn)行提取1 h，將提取液在40 ℃下減壓濃縮至30 mL，冷卻后置于 4 ℃冰箱中待用。

(4)拓展：提取工藝中藥材取樣量、溶媒體積和提取時(shí)間等可根據(jù)實(shí)驗(yàn)室條件和教學(xué)需要進(jìn)行適時(shí)調(diào)整，為便于方案對比建議三種方案取樣量、溶媒體積和提取時(shí)間保持一致，當(dāng)然也可以針對一種提取方式，在固定固液比條件下，改變提取時(shí)間、溫度和溶劑配比優(yōu)化最佳提取工藝，賦予實(shí)驗(yàn)操作靈活性，給學(xué)生提供自我發(fā)揮的空間，實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)的自控性和探究性特點(diǎn)。

2.2.2 綠原酸對照品標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

(1)稱取10 mg綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品，用60%乙醇稀釋定容至 50 mL，得綠原酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液，分別移取儲備液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL定容，在326 nm下測定各溶液吸光度值，以吸光度值為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)樣品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制工作曲線，線性擬合得到線性回歸方程。

(2)拓展：對照品濃度和標(biāo)準(zhǔn)溶液的移取體積及溶劑學(xué)生可以自行調(diào)控，但要有文獻(xiàn)依據(jù)，讓學(xué)生了解科研實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要有規(guī)可循。

2.2.3 綠原酸樣品溶液的制備和含量測定

(1)采用逐級稀釋法將上述提取液稀釋適當(dāng)倍數(shù)作為樣品溶液，以相應(yīng)體積比的乙醇作為空白，用紫外可見分光光度計(jì)測定樣品溶液的吸光度，利用回歸方程計(jì)算供試品綠原酸含量。為提高實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確度，每個(gè)提取工藝重復(fù)3次，培養(yǎng)學(xué)生嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目蒲凶黠L(fēng)。

(2)回收率試驗(yàn)：取空白殘?jiān)鼧悠?，每份稱取 5 g，分別加入綠原酸對照品溶液適量，配置成濃度分別為5、10、15 μg/mL的對照品溶液，每個(gè)質(zhì)量濃度 3份，制備供試品溶液，檢測，計(jì)算回收率。

(3)準(zhǔn)確度和精密度試驗(yàn)：空白樣品按 2、5、8 μg/g 3 個(gè)水平添加標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)水平平行測定 6 次，考察方法的準(zhǔn)確度與精密度。

(4)拓展：探討設(shè)計(jì)高效液相色譜法定量測定綠原酸的方法，并與紫外分光光度法測定結(jié)果進(jìn)行對照，檢驗(yàn)方法的準(zhǔn)確度。

3 實(shí)驗(yàn)過程

3.1 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

本階段主要是根據(jù)學(xué)生所學(xué)專業(yè)基礎(chǔ)知識和醫(yī)藥企業(yè)見習(xí)了解的藥物提取及質(zhì)量監(jiān)控相關(guān)知識，查閱相關(guān)文獻(xiàn)和資料完成以下準(zhǔn)備工作。

(1)了解綠原酸結(jié)構(gòu)性質(zhì)，中藥提取工藝流程所涉及各種參數(shù)，學(xué)習(xí)綠原酸提取工藝參數(shù)選擇與優(yōu)化方法，初步設(shè)定工藝優(yōu)化參數(shù)，培養(yǎng)學(xué)生科研實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)能力；

(2)了解中藥提取工藝質(zhì)量監(jiān)控方法，掌握相關(guān)儀器設(shè)備，比如紫外分光光度計(jì)、超聲波清洗機(jī)、索氏提取等實(shí)驗(yàn)裝置的操作方法，培養(yǎng)學(xué)生動(dòng)手操作能力；

(3)根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)目標(biāo)，學(xué)生成立實(shí)驗(yàn)小組討論確定綠原酸提取工藝參數(shù)，制定工藝優(yōu)化策略，設(shè)計(jì)詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)步驟，培養(yǎng)學(xué)生分析解決問題能力和科研合作精神。

3.2 實(shí)驗(yàn)安排

本實(shí)驗(yàn)為藥學(xué)專業(yè)四年級本科生第七學(xué)期醫(yī)藥企業(yè)見習(xí)周開設(shè)，在醫(yī)藥企業(yè)見習(xí)周先安排兩天的醫(yī)藥企業(yè)見習(xí)內(nèi)容，然后根據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研和醫(yī)藥企見習(xí)了解的中藥提取工藝所涉及問題開設(shè)本次實(shí)驗(yàn)，總學(xué)時(shí)30學(xué)時(shí)，具體安排如下：理論講解2學(xué)時(shí)，綠原酸含量測定方法建立2學(xué)時(shí)，綠原酸各種提取工藝操作20學(xué)時(shí)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理，繪圖與數(shù)據(jù)分析5學(xué)時(shí)。試驗(yàn)完成后要求學(xué)生撰寫科研小論文，制作PPT對實(shí)驗(yàn)過程和實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行總結(jié)，匯報(bào)、交流和討論。

3.3 課上實(shí)驗(yàn)操作

(1)按照設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)步驟，依據(jù)儀器分析和藥物分析實(shí)驗(yàn)藥品定量測定操作要求，準(zhǔn)確配置綠原酸對照品標(biāo)準(zhǔn)溶液，并利用紫外分光光度計(jì)在設(shè)定波長下測定標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值，利用數(shù)據(jù)處理軟件Excel或 origin作圖并進(jìn)行線性擬合，得到綠原酸含量測定線性回歸方程y=0.027x-0.0012(r=0.9998)。

(2)按照設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)步驟，設(shè)定綠原酸提取方案，依據(jù)不同提取方法并依次按照醇水、乙醇和乙酸乙酯不同溶媒設(shè)計(jì)提取試驗(yàn)工藝，按照設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)步驟，測定不同方案下綠原酸綜合得率。

綠原酸的提取率按下式計(jì)算：

式中：K為稀釋倍數(shù);V為減壓蒸餾后的溶劑體積,mL;C為測定的綠原酸質(zhì)量濃度,mg/mL;w為稱取的金銀花的質(zhì)量,g。

3.4 課后探究分析

本階段主要是對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，總結(jié)數(shù)據(jù)規(guī)律，對試驗(yàn)中出現(xiàn)的問題及可能對實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生影響的因素進(jìn)行分析和探討，側(cè)重于學(xué)生面向工廠生產(chǎn)的實(shí)際問題進(jìn)行分析和探討，鍛煉學(xué)生分析問題和解決問題的能力。

表1 綠原酸的提取工藝設(shè)計(jì)實(shí)例Table 1 Example of extraction process design of chlorogenic acid

(1)結(jié)果分析

讓學(xué)生根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析不同提取工藝提取效率，依據(jù)醫(yī)藥企業(yè)見習(xí)中所了解的關(guān)于藥物提取工藝知識對所得結(jié)果的合理性做出判斷。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：由于綠原酸極性較大，所以極性大溶劑更有利于綠原酸的提取。在索氏提取方法中甲醇作為提取溶媒時(shí)效果最優(yōu)，提取得率為3.79%。隨著提取溶媒極性降低，綠原酸的提取效率依次降低，由此可得出：除提取技術(shù)外，提取溶媒極性可能是影響提取效率的主要因素，在提取工藝一定的情況下應(yīng)盡可能選擇極性大的溶媒。該實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果既能為工業(yè)提取工藝設(shè)置提供理論依據(jù)，也提升了學(xué)生對專業(yè)學(xué)習(xí)的認(rèn)同度。

(2)回收率試驗(yàn)

空白樣品添加綠原酸標(biāo)準(zhǔn)工作液，按照2.3.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，檢測，計(jì)算回收率，結(jié)果顯示平均回收率分別為 98. 45%、99. 59%、98. 32%，RSD = 0. 81%。

(3) 準(zhǔn)確度和精密度試驗(yàn)

空白樣品按 2、5、8 μg/g 3 個(gè)水平添加標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)水平平行測定 6 次，考察方法的準(zhǔn)確度和精密度，結(jié)果見表3。 表3表明綠原酸的平均回收率介于 84.6%～87.8%之間，變異系數(shù)≤9.6%，說明該定量方法有良好的準(zhǔn)確度和精密度。

表2 綠原酸提取工藝結(jié)果Table 2 Results of chlorogenic acid extraction process

表3 不同樣品中添加綠原酸的R及RSDTable 3 The recovery rate and relative standard deviation of chlorogenic acid in different concentrations of samples

(4)實(shí)驗(yàn)總結(jié)。按照科技論文格式撰寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告，包括分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)并得出結(jié)論，總結(jié)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)心得與操作注意事項(xiàng)，鍛煉學(xué)生科研論文寫作能力。

(5)實(shí)驗(yàn)拓展。為滿足學(xué)生科研探索需求，可設(shè)計(jì)探索提取工藝溶媒配比變化對提取效率的影響，為綠原酸工業(yè)生產(chǎn)探索最佳生產(chǎn)工藝。另外，高效液相色譜法在藥物定量分析中具有獨(dú)特優(yōu)勢，可以拓展高效液相色譜對綠原酸的定量方法并與紫外可見分光光度法進(jìn)行對比，檢驗(yàn)結(jié)果的可信度，培養(yǎng)學(xué)生嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)態(tài)度。

4 結(jié) 語

以培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新能力和實(shí)踐能力為目的，設(shè)計(jì)了探究性藥學(xué)專業(yè)實(shí)驗(yàn)—金銀花中綠原酸的提取工藝研究。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)過程需要學(xué)生借助分析化學(xué)、儀器分析、藥物分析、天然藥物化學(xué)、文獻(xiàn)檢索與寫作、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)處理等多門專業(yè)課程的理論知識與企業(yè)見習(xí)所學(xué)實(shí)踐知識設(shè)計(jì)綠原酸提取方法和工藝，實(shí)現(xiàn)了專業(yè)知識與實(shí)踐技能的融合。綠原酸提取工藝的優(yōu)化以綠原酸的性質(zhì)為基礎(chǔ)確定影響提取效率的重要因素，試驗(yàn)工藝的設(shè)定參照文獻(xiàn)調(diào)研和企業(yè)見習(xí)，實(shí)驗(yàn)過程差異性和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不確定性，提高了實(shí)驗(yàn)挑戰(zhàn)度，可有效培養(yǎng)學(xué)生科研素質(zhì)。實(shí)驗(yàn)前文獻(xiàn)調(diào)研和教師的講解相結(jié)合，可開闊學(xué)生的視野，鍛煉學(xué)生查閱、整理資料以及設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的能力。實(shí)驗(yàn)中提取表征設(shè)備使用、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理分析及繪圖等培養(yǎng)學(xué)生動(dòng)手操作能力，同時(shí)為滿足學(xué)生科學(xué)探索需求對可實(shí)驗(yàn)內(nèi)容實(shí)時(shí)拓展，提高學(xué)生的科研能力和創(chuàng)新精神，為日后從事科研或走向?qū)I(yè)技術(shù)崗位奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。文章所設(shè)計(jì)的探究性實(shí)驗(yàn)即可作為高年級藥學(xué)專業(yè)的綜合性實(shí)驗(yàn)，也可作為高年學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目，是對藥學(xué)專業(yè)實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革的嘗試和探索。在當(dāng)前創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)教育背景下，需要依據(jù)科研生產(chǎn)發(fā)展趨勢和“金課”標(biāo)準(zhǔn)改革現(xiàn)有的教學(xué)內(nèi)容和教學(xué)方式，探究性綜合實(shí)驗(yàn)改變了驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)的教學(xué)模式，讓學(xué)生更主動(dòng)的參與到實(shí)驗(yàn)教學(xué)過程，由于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)貼近科研和生產(chǎn)實(shí)踐，在文獻(xiàn)調(diào)研和試驗(yàn)工藝設(shè)計(jì)過程中訓(xùn)練學(xué)生的科研創(chuàng)新能力，融合了科研育人功能，提高了課程的挑戰(zhàn)度。由于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)融合了醫(yī)藥企業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為醫(yī)藥企業(yè)中藥提取提供理論參考，實(shí)現(xiàn)研以致用，增加學(xué)生專業(yè)認(rèn)同度。當(dāng)然藥學(xué)探究性實(shí)驗(yàn)的實(shí)施在要求學(xué)生改變原有的實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)思維的同時(shí)，作為實(shí)驗(yàn)教學(xué)的高校教師首先要努力更新教學(xué)理念，轉(zhuǎn)換教學(xué)角色，緊跟“金課”步伐，感知學(xué)生的教與學(xué)，與學(xué)生形成共同體，運(yùn)用嚴(yán)謹(jǐn)?shù)娜X教學(xué)原則設(shè)計(jì)課程[12]。在目前我國線下“金課”打造無論是數(shù)量還是品質(zhì)還處于緩慢發(fā)展階段及相關(guān)研究薄弱的背景下，探索藥學(xué)專業(yè)實(shí)踐性“金課”建設(shè)案例具有重要實(shí)踐意義。