王海賀，王 璐，李 玲，王武龍

(1.巴彥淖爾市醫(yī)院藥劑科，內(nèi)蒙古 巴彥淖爾 015000；2.包頭醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院腫瘤科，內(nèi)蒙古 包頭 014030)

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是由氣道和肺實質慢性炎癥引起的以進行性氣流受限為特征的疾病。目前西醫(yī)治療COPD多采用支氣管擴張劑、抗生素聯(lián)合糖皮質激素治療，可暫時緩解癥狀，但是COPD反復發(fā)作，難以痊愈，預后較差[1]。因此，尋找有效的治療方法改善COPD患者預后尤為迫切。中醫(yī)認為肺為嬌臟，容易感邪，遷延失治，痰瘀稽留，損傷正氣，急性加重期以實為主，表現(xiàn)為痰熱，治法為清肺化痰、降逆平喘。藏紅花是名貴中藥材，其具有祛痰、鎮(zhèn)靜、解痙的作用。藏紅花素是藏紅花的活性成分，其通過抗氧化、抗炎機制對脂多糖誘導的膿毒癥及其心臟毒性具有一定預防作用[2]。藏紅花素可抑制COPD大鼠肺泡上皮細胞凋亡，改善氣道炎癥。NOD樣受體蛋白3(Nod-like receptor pyrin domain 3，NLRP3)炎癥小體是一種多蛋白復合物，可促進產(chǎn)生白細胞介素(Interleukin，IL)-1β等促炎細胞因子，進而誘發(fā)加重COPD氣道炎癥[3-4]。目前煙熏聯(lián)合氣道內(nèi)滴注脂多糖，結合鼻腔給菌是誘導COPD急性加重期大鼠模型的重要方法[5]。本研究擬通過NLRP3探討藏紅花素對COPD急性加重期大鼠肺功能和炎癥反應的影響，以期為臨床用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：6周齡SPF級雄性Wistar大鼠，體重(200±20)g，動物許可證號SCXK(京)2016-0011，購自北京維通利華實驗動物有限公司。大鼠飼養(yǎng)于24～25 ℃，濕度50%，光照、黑暗各12 h的動物房中，自由采食和飲水。

1.1.2 實驗藥物與試劑：藏紅花素(批號YY90210)購自上海源葉生物科技有限公司；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(批號C1091)、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)檢測試劑盒(批號S0131)、乳酸脫氫酶(Lactic dehydrogenase，LDH)釋放檢測試劑盒(批號C0017)、磷酸甘油醛脫氫酶(Glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)兔單抗(批號AF1186)、NLRP3兔單抗(批號AF2155)、山羊抗兔IgG(批號A0208)、Trizol(批號R0016)、大鼠IL-1β ELISA檢測試劑盒(批號P1303)購自上海碧云天生物公司；逆轉錄試劑盒、SYBR Green Master Mix購自北京寶日醫(yī)生物公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 COPD加重期模型的制備：參照煙熏聯(lián)合氣道內(nèi)滴注脂多糖，并結合鼻腔給菌法建立COPD急性加重期模型，即在實驗第1～28天(除7、14、28 d外)將大鼠放置于玻璃煙熏箱，5%煙霧濃度煙熏30 min，然后將大鼠轉移到正常環(huán)境中飼養(yǎng)。在實驗第7、14、28天，在氣管內(nèi)滴入0.2 ml濃度為1 g/L的內(nèi)毒素。第29～32天，鼻腔內(nèi)滴注0.3 ml 2.4×109CFU/ml的金黃色葡萄球菌溶液，2次/d[5]。對照組大鼠氣道和鼻腔內(nèi)每次滴注等體積0.9%氯化鈉溶液。

1.2.2 分組和給藥：將40只大鼠隨機分為對照組、模型組、藏紅花素小劑量組(10 mg/kg藏紅花素)、藏紅花素大劑量組(50 mg/kg藏紅花素)，每組10只。在實驗第4天煙熏前1 h，藏紅花素小、大劑量組大鼠分別腹腔注射10、50 mg/kg的藏紅花素溶液[6]，每日1次，直到造模結束。造模結束24 h后進行肺功能檢測，抽取動脈血，摘取肺組織。

1.2.3 肺功能指標檢測：用10%水合氯醛腹膜內(nèi)麻醉大鼠，固定頭部和四肢，頸部消毒后，鈍性逐層分離頸部皮下組織直至氣管暴露，氣管插管，連接FGC-A+型全自動肺功能測試儀，記錄大鼠的0.3秒用力呼氣容積與用力肺活量比值(FEV0.3/FVC)、呼氣峰流量(Peak expiratory flow，PEF)以及吸氣峰流量(Peak inspirator flow，PIF)[7]。

1.2.4 TUNEL染色檢測大鼠肺組織肺泡上皮細胞凋亡：將肺組織用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，隨后切成4 μm厚組織切片。二甲苯脫蠟后，入梯度乙醇直至水化。按照TUNEL試劑盒步驟染色。每個切片隨機選擇5個視野計數(shù)，以凋亡細胞和視野總細胞數(shù)目的比值表示細胞凋亡率。

1.2.5 比色法檢測大鼠血清MDA、LDH水平：抽取大鼠動脈血，25 ℃靜置60 min，2000 r/min離心20 min后分離血清，采用MDA檢測試劑盒、LDH活性檢測試劑盒檢測大鼠血清MDA、LDH水平。

1.2.6 Western blot檢測肺組織NLRP3蛋白表達：RIPA法提取肺組織總蛋白，定量后進行SDS-PAGE，濕法轉膜后，脫脂奶粉封閉，隨后依次加入一抗(NLRP3抗體1∶1000稀釋，GAPDH抗體1∶2000稀釋)和二抗(1∶1000稀釋)進行免疫反應，然后加入化學發(fā)光試劑顯色。以GAPDH為內(nèi)參，用Image J軟件分析目標條帶的相對灰度值。

1.2.7 RT-qPCR檢測大鼠肺組織NLRP3 mRNA表達：以Trizol試劑提取肺組織總RNA，用逆轉錄試劑盒將1 μg總RNA反轉錄為cDNA，利用SYBR Green Master Mix配制20 μl反應體系，采用CFX96 Real-Time PCR檢測系統(tǒng)檢測NLRP3 mRNA表達。用2-△△Ct法分析NLRP3 mRNA相對表達量。NLRP3上游引物5’-CAGCGATCAACAGGCGAGAC-3’，下游引物5’-AGAGATATCCCAGCAAACCTATCCA-3’；GAPDH上游引物5’-GAACATCATCCCTGCATCCA-3’，下游引物CCAGTGAGCTTCCCGTTCA-3’。

1.2.8 ELISA檢測血清IL-1β水平：按照ELISA試劑盒說明書檢測各組大鼠血清IL-1β水平。

2 結 果

2.1 各組大鼠肺功能指標比較 與對照組比較，模型組大鼠PEF、PIF、FEV0.3/FVC均顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，藏紅花素小、大劑量組大鼠PEF、PIF、FEV0.3/FVC均顯著升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠肺功能指標比較

2.2 各組大鼠肺組織肺泡上皮細胞凋亡率比較 對照組、模型組和藏紅花素小、大劑量組大鼠肺組織肺泡上皮細胞凋亡率分別是(2.99±0.14)%、(35.05±2.28)%、(24.40±1.32)%、(11.21±0.86)%。與對照組比較，模型組大鼠肺泡上皮細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，藏紅花素小、大劑量組大鼠肺泡上皮細胞凋亡率均顯著降低(P<0.05)(圖1)。

圖1 各組大鼠肺組織肺泡上皮細胞凋亡情況(TUNEL染色，×400)

2.3 各組大鼠血清MDA、LDH水平比較 與對照組比較，模型組大鼠血清MDA和LDH水平均顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，藏紅花素小、大劑量組大鼠血清MDA和LDH水平均顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血清MDA、LDH水平比較

2.4 各組大鼠肺組織NLRP3 mRNA、NLRP3蛋白表達比較 與對照組比較，模型組大鼠肺組織NLRP3 mRNA、NLRP3蛋白水平均顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，藏紅花素小、大劑量組大鼠肺組織中NLRP3 mRNA、NLRP3蛋白水平均顯著降低(P<0.05)。見表3(圖2)。

表3 各組大鼠肺組織NLRP3 mRNA、NLRP3蛋白表達比較

圖2 各組大鼠肺組織NLRP3蛋白表達

2.5 各組大鼠血清IL-1β水平比較 干預后，對照組、模型組及藏紅花素小、大劑量組大鼠血清IL-1β水平分別為(50.14±1.66)、(273.61±18.73)、(188.83±14.20)、(92.52±9.07)pg/ml。與對照組比較，模型組大鼠血清IL-1β水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，藏紅花素小、大劑量組大鼠血清IL-1β水平均顯著降低(P<0.05)。

3 討 論

慢性支氣管炎和氣道阻塞是COPD的主要病理特征，吸煙、感染等有害刺激可誘發(fā)肺部異常炎癥，加重COPD患者呼吸道癥狀，降低肺功能。研究指出，中藥及其活性成分通過抑制氧化應激和炎癥反應保護肺功能[8]。肺功能檢測是評估COPD病情嚴重程度、預后及評定療效的重要方法[9-10]。本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，藏紅花素處理后大鼠PEF、PIF、FEV0.3/FVC顯著升高，且與藏紅花素劑量呈正相關，表明藏紅花素可改善COPD急性加重期大鼠的肺功能。COPD患者及大鼠肺泡上皮細胞異常凋亡與肺組織病理改變或肺功能改變有關[11]。本研究結果顯示，藏紅花素處理后，COPD急性加重期大鼠肺泡上皮細胞凋亡率顯著降低，這與藏紅花素處理后肺功能得到改善相吻合。慢性炎癥是COPD發(fā)病的核心機制，COPD急性加重期患者血清和肺泡灌洗液中IL-1β、IL-6等促炎因子水平顯著增加，其與巨噬細胞活化和中性粒細胞炎癥浸潤有關[12]。已有報道顯示，西紅花苷可減輕博萊霉素誘導的肺纖維化模型大鼠的炎癥反應和肺血管功能障礙[13]。同時，藏紅花素可通過改善抗氧化防御，減少促炎介質TNF-α、IL-1β產(chǎn)生，抑制甲氨蝶呤誘導的肝毒性反應[14]。本研究中，藏紅花素以劑量依賴方式抑制大鼠血清中促炎因子IL-1β、脂質過氧化副產(chǎn)物MDA水平以及細胞損傷標志物LDH水平，表明藏紅花素通過抑制氧化應激和炎癥反應進而改善COPD急性加重期大鼠肺功能。

NLRP3是一種細胞內(nèi)受體，其通過與PAMP等結合激活Caspase-1誘導促炎因子IL-1β和IL-18活化和釋放，介導宿主促炎反應，參與COPD等呼吸系統(tǒng)疾病進展[15]。研究表明，COPD動物模型肺組織NLRP3表達水平與肺功能損傷程度相關[16]。COPD患者血清IL-1β水平升高，且其表達水平與疾病嚴重程度相關[17]。氧化應激可介導NLRP3炎性小體活化促進COPD進展[18]。藏紅花素通過抑制NLRP3信號通路減輕脂多糖誘導的焦慮和抑郁樣行為，改善大鼠糖尿病腎病相關的炎癥和氧化應激反應[19-20]。本研究中藏紅花素處理后，大鼠肺組織NLRP3水平顯著降低，血清IL-1β水平降低，表明藏紅花素可能通過下調(diào)NLRP3表達改善COPD患者肺功能。

綜上所述，藏紅花素通過下調(diào)NLRP3表達改善COPD急性加重期大鼠的肺功能，抑制氧化應激和炎癥反應，抑制肺泡上皮細胞凋亡。