魏耀昶，劉青云，程佳瑞，鄒超霞，鄧彥飛

（廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院亞熱帶生物資源保護(hù)與利用國家重點實驗室，廣西 南寧 530004）

因水牛具有耐粗飼、耐高溫、抗病力強(qiáng)，以及奶營養(yǎng)價值高等優(yōu)勢，水牛養(yǎng)殖業(yè)已成為廣西的特色支柱產(chǎn)業(yè)。但是水牛卵巢生長卵泡少，卵泡閉鎖率高，嚴(yán)重制約了水牛產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此，探究水牛卵泡發(fā)育和卵泡閉鎖機(jī)制有助于提高水牛繁殖效率。

顆粒細(xì)胞的凋亡被認(rèn)為是卵泡閉鎖的重要誘導(dǎo)因子[1]，其增殖分裂、調(diào)亡、分泌的類固醇激素和細(xì)胞因子對卵泡的發(fā)育及閉鎖起著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用，卵母細(xì)胞所需的營養(yǎng)物質(zhì)如核酸、能量是通過顆粒細(xì)胞獲得的[2]。卵泡中10%以上的顆粒細(xì)胞凋亡后，認(rèn)為該卵泡已經(jīng)閉鎖；因細(xì)胞凋亡是不可逆的，所以卵泡閉鎖也是不可逆轉(zhuǎn)的，一旦發(fā)生閉鎖，卵泡就不能繼續(xù)正常發(fā)育。

TGF-β超家族是一組結(jié)構(gòu)保守但功能多樣的蛋白質(zhì)，在脊椎動物中至少有35個成員。這些蛋白質(zhì)廣泛分布于全身，作為細(xì)胞外配體參與產(chǎn)前和產(chǎn)后的許多生理過程。大多數(shù)TGF-β超家族成員通過與細(xì)胞表面指定為I型和II型的兩種絲氨酸/蘇氨酸激酶受體結(jié)合并形成異源四聚體復(fù)合物，對靶細(xì)胞發(fā)揮作用[3]。越來越多的試驗證據(jù)支持它們在卵泡發(fā)育的多個方面發(fā)揮關(guān)鍵作用的說法，包括原始卵泡募集、顆粒和卵泡膜細(xì)胞增殖/閉鎖、類固醇生成、促性腺激素受體表達(dá)、卵母細(xì)胞成熟、排卵、黃體化和黃體（CL）形成[4-5]。然而，關(guān)于TGF-β調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞狀態(tài)的研究仍然有爭議。有報道顯示，TGF-β可以通過smad通路增加顆粒細(xì)胞的凋亡率[6-7]。也有報道顯示，TGF-β單獨作用對顆粒細(xì)胞無影響，而TGF-β與 TGF-α協(xié)同作用就可以誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞凋亡，促進(jìn)卵泡閉鎖[8]。

為了進(jìn)一步探究TGF-β對卵泡顆粒細(xì)胞的影響，本研究以水牛為對象，重點關(guān)注TGF-β對水牛顆粒細(xì)胞狀態(tài)的影響，為研究TGF-β對卵泡發(fā)育的影響提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

DMEM高糖基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基（Gibco）、胎牛血清（Gibco）、青霉素/鏈霉素和胰酶均購自北京索萊寶公司；CCK-8試劑購自諾唯贊生物科技有限公司；BD pharmingen FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit1購自BD生物科技公司；牛孕酮和雌激素ELISA檢測試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司；TGF-β購自北京索萊寶公司。

1.2 水牛卵泡顆粒細(xì)胞的體外培養(yǎng)

從南寧當(dāng)?shù)赝涝讏霾杉侨焉锼５穆殉玻湃?7℃滅菌生理鹽水，1 h內(nèi)運回實驗室進(jìn)行試驗。卵巢先用75%的酒精潤洗消毒，剪下多余的卵巢系膜組織，之后用37℃生理鹽水清洗3遍，將血水洗凈。將清洗干凈的卵巢置于高壓滅菌后的紗布上，選取3～9 mm的卵泡，用15 mL注射器吸取卵泡中的卵泡液，并收集在離心管中。將收集的卵泡液用40μm的細(xì)胞篩過篩，收集液體，1500 rpm離心3 min。棄上清，用含雙抗的PBS清洗顆粒細(xì)胞3遍，并離心棄上清。用含雙抗和10%胎牛血清的DMEM重懸顆粒細(xì)胞，并置于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)（37 ℃，5% CO2），12 h 后更換無雙抗的DMEM。

1.3 CCK-8檢測

取對數(shù)生長期的水牛卵泡顆粒細(xì)胞培養(yǎng)在96孔板中，用 0 ng/mL、1 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL濃度的 TGF-β 分別于 1 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h、48 h（每組3個重復(fù)）處理水牛卵泡顆粒細(xì)胞。分別向每個孔中添加10μL CCK-8試劑，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h。利用酶標(biāo)儀（TECAN公司）在450 nm處檢測OD值。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測

取對數(shù)生長期的水牛卵泡顆粒細(xì)胞培養(yǎng)在24孔板中。根據(jù)CCK-8結(jié)果選取20 ng/mL的濃度，分別于 1 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h、48 h （每組 3 個重復(fù)）處理水牛卵泡顆粒細(xì)胞。用胰酶消化后將細(xì)胞收集在1.5 mL離心管中，并用PBS清洗1次。加入500μL binding buffer，輕柔吹打均勻后，分別加入5 μL Annexin V FITC和10μL PI。吹打混勻后 15 min內(nèi)利用流式細(xì)胞儀檢測。

1.5 孕酮和雌激素的檢測

取對數(shù)生長期的水牛卵泡顆粒細(xì)胞培養(yǎng)在24孔板中。根據(jù)CCK-8結(jié)果選取20 ng/mL的濃度培養(yǎng)水牛卵泡顆粒細(xì)胞24 h。收集細(xì)胞培養(yǎng)液，用ELISA試劑盒檢測培養(yǎng)液中E2和PROG濃度。用酶標(biāo)儀(TECAN)按照制造商的方案檢測樣品。E2和PROG的檢測范圍分別為40～1 000 pg/mL和0.15～70 ng/mL。檢測靈敏度分別為40 pg/mL和0.5 ng/mL，檢測內(nèi)變異系數(shù)均小于15%。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 8.0進(jìn)行分析。兩組間的統(tǒng)計學(xué)差異采用t檢驗，超過兩組的統(tǒng)計學(xué)差異采用方差分析（ANOVA）。P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 TGF-β對水牛卵泡顆粒細(xì)胞增殖的影響

為了檢測TGF-β對水牛卵泡顆粒細(xì)胞增殖的影響，本試驗利用CCK-8試劑盒分別檢測了不同濃度和不同處理時間后的OD值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著TGF-β濃度的升高，OD值逐漸升高（如圖1所示），TGF-β在不同培養(yǎng)時間下，OD值逐漸上升的趨勢不變，證明TGF-β可以促進(jìn)水牛卵泡增殖。當(dāng)TGF-β添加劑量為20 ng/mL時，無論培養(yǎng)多長時間，其OD值都顯著高于其他處理組，在處理24 h后，隨著TGF-β濃度的升高，OD值不再增加。

圖1 TGF-β對水牛卵泡顆粒細(xì)胞增殖的影響

2.2 TGF-β對水牛卵泡顆粒細(xì)胞凋亡的影響

為檢測TGF-β對水牛卵泡顆粒細(xì)胞凋亡的影響，本試驗使用流式細(xì)胞術(shù)分別檢測了添加20 ng/mL的TGF-β作用不同時間卵泡顆粒細(xì)胞的凋亡率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用20 ng/mL的TGF-β處理水牛卵泡顆粒細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡率沒有顯著變化，且隨著處理時間的延長，卵泡顆粒細(xì)胞的凋亡率仍然沒有顯著變化（如圖2-1、2-2所示）。

圖2-1 TGF-β對水牛卵泡顆粒細(xì)胞凋亡的影響

圖2-2 TGF-β對水牛卵泡顆粒細(xì)胞凋亡的影響

2.3 TGF-β對水牛卵泡顆粒細(xì)胞分泌孕酮（P4）的影響

在卵泡發(fā)育過程中，類固醇激素的生成和分泌對卵泡閉鎖有直接影響。本研究利用ELISA檢測了添加20 ng/mL的TGF-β處理水牛卵泡顆粒細(xì)胞24 h后，細(xì)胞培養(yǎng)液中的孕酮含量。結(jié)果顯示，用20 ng/mL的TGF-β處理水牛卵泡顆粒細(xì)胞24 h后，可以顯著降低水牛卵泡顆粒細(xì)胞孕酮的分泌量（如圖3所示）。

圖3 TGF-β對水牛卵泡顆粒細(xì)胞分泌孕酮（P4）的影響

2.4 TGF-β對水牛卵泡顆粒細(xì)胞分泌雌激素（E2）的影響

分泌雌激素是卵泡顆粒細(xì)胞最重要的功能之一。本研究利用ELISA檢測了添加20 ng/mL的TGF-β處理水牛卵泡顆粒細(xì)胞24 h后，細(xì)胞培養(yǎng)液中雌激素的含量。結(jié)果顯示，用20 ng/mL的TGF-β處理水牛卵泡顆粒細(xì)胞24 h后，細(xì)胞培養(yǎng)液中雌激素的含量沒有顯著變化（如圖4所示）。

圖4 TGF-β對水牛卵泡顆粒細(xì)胞分泌孕酮（E2）的影響

3 討論

顆粒細(xì)胞的凋亡對卵泡閉鎖至關(guān)重要，細(xì)胞凋亡是機(jī)體自發(fā)的程序性死亡，而促使卵泡顆粒細(xì)胞凋亡的因素眾多。生殖激素是影響卵泡顆粒細(xì)胞增殖、生長和凋亡最重要的因素，并且?guī)缀跛械纳臣に囟紖⑴c其中，如 GnRH[9]、FSH[10]、LH[10]等。 在與凋亡相關(guān)基因的研究中發(fā)現(xiàn)， 促凋亡基因（FAS、P53、BCL2、BAX、Cas-3、Cas-9等）在卵泡閉鎖中可以促進(jìn)顆粒細(xì)胞的凋亡[11]。另外在卵泡閉鎖期間，不僅促凋亡基因Bcl-2家族的表達(dá)升高，而且抗凋亡基因的表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平上增加，在閉鎖卵泡中Bid、Bim、Bcl-2和Mcl-1基因高表達(dá)，而caspase-3、BAX和BCL-xl基因在閉鎖卵泡中高表達(dá)[12]。細(xì)胞因子存在相互協(xié)同、相互制約等作用，生物學(xué)功能復(fù)雜，已經(jīng)有大量研究證實了各類細(xì)胞因子在卵泡顆粒細(xì)胞凋亡過程中的作用。據(jù)報道，EGF刺激卵泡顆粒細(xì)胞的增殖，增加黃體酮、cAMP、cGMP的釋放，控制雌二醇的釋放，此外它刺激卵母細(xì)胞成熟、卵丘細(xì)胞增殖及維持卵泡存活[13]。10 ng/mL FGF-2可以抑制細(xì)胞凋亡并促進(jìn)羊卵泡的生長[14]。有大量研究顯示，轉(zhuǎn)化因子TGF-β對卵泡發(fā)育至關(guān)重要，然而對TGF-β的研究還存在爭議。

本試驗結(jié)果顯示，在體外培養(yǎng)的水牛卵泡顆粒細(xì)胞中添加TGF-β后可以顯著增加水牛卵泡顆粒細(xì)胞的增殖能力，而對凋亡沒有顯著影響。這說明TGF-β對水牛卵泡顆粒細(xì)胞沒有負(fù)面影響，更有利于水牛卵泡的發(fā)育。同時，本試驗結(jié)果顯示，TGF-β可以顯著抑制水牛卵泡顆粒細(xì)胞產(chǎn)生孕酮，而對雌激素沒有影響，這使得孕激素與雌激素的比例減少。據(jù)報道，卵泡中E2和P4的失衡與卵泡閉鎖有關(guān)，在卵泡閉鎖的過程中，E2濃度相對降低，P4濃度相對升高,兩者比例變化已成為鑒定卵泡閉鎖與否的重要指標(biāo)[15]。因此，TGF-β可以減少孕酮與雌激素的比例，抑制水牛卵泡的閉鎖。然而，TGF-β到底通過什么途徑影響水牛卵泡顆粒細(xì)胞的狀態(tài)，還需要進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

TGF-β可以通過促進(jìn)水牛卵泡顆粒細(xì)胞的增殖、減少孕激素與雌激素的比例來減少水牛卵泡的閉鎖，增加卵泡顆粒細(xì)胞的活力。