許芮菁，劉敏，楊銳，高林瑞，丁章貴，3，4*，陳丹丹*

（1.云南大益微生物技術(shù)有限公司，云南昆明 650217；2.云南省普洱茶發(fā)酵工程研究中心，云南昆明 650217；3.云南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院云南省微生物研究所，云南昆明 650091；4.云南大學(xué)西南微生物多樣性教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650091）

鞣花酸（Ellagic acid，EA）是一種具有生物活性的酚類化合物，廣泛存在于水果、堅(jiān)果等植物組織中[1]，其結(jié)構(gòu)如圖1 所示，是一種沒食子酸的二聚衍生物。 在自然界中， 鞣花酸主要以縮合形式（如鞣花單寧等）存在[2]。鞣花酸基本無毒性[3]，對(duì)化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)的癌變及其它多種癌變具有明顯的抑制作用，如結(jié)腸癌[4-5]、肝癌[6]、肺癌[7]、前列腺癌[8-9]、乳腺癌[10]、淋巴癌[11]等。此外，鞣花酸還具有抗氧化[12]、抗炎癥[13]、抑菌[14]、抑制黑色素生成[15]、改善白血病[16]等功效。 由于其優(yōu)異的生物活性，鞣花酸被廣泛應(yīng)用于保健食品[17-18]、醫(yī)療[19-20]、醫(yī)藥[21-22]、化妝品[23-25]等領(lǐng)域。

圖1 鞣花酸分子結(jié)構(gòu)式Fig.1 The molecular structures of EA

有研究表明， 茶葉是鞣花單寧和鞣花酸的重要膳食來源，鞣花單寧通過人體腸道微生物轉(zhuǎn)化，會(huì)轉(zhuǎn)化為鞣花酸等代謝產(chǎn)物[26]。普洱熟茶作為云南名茶， 是由云南大葉種曬青毛茶制成的一種獨(dú)特微生物發(fā)酵茶[27]。普洱熟茶“固態(tài)發(fā)酵”的實(shí)質(zhì)主要是濕熱作用、酶作用以及微生物作用[28]。 大葉種曬青毛茶發(fā)酵過程中，微生物代謝釋放大量熱量，其分泌的酶與茶葉內(nèi)含物發(fā)生激烈的酶促反應(yīng)，二者均能促進(jìn)具有熱不穩(wěn)定性的鞣花單寧（如木麻黃素）[29]分解形成鞣花酸。 建立普洱熟茶中鞣花酸含量的檢測方法， 可滿足普洱熟茶中特征活性成分的質(zhì)量控制需求， 同時(shí)有助于普洱茶發(fā)酵過程中特征性物質(zhì)的變化趨勢(shì)及微生物的代謝規(guī)律研究，為普洱茶的工業(yè)化可控發(fā)酵提供方法依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

Waters e2695 高效液相色譜儀（美國，Waters公司）；Waters 2995 PDA （光電二極管列陣檢測器，美國，Waters 公司）；WD-9415B 超聲儀（北京六一儀器廠）；H1850R 低溫離心機(jī)（湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；VORTEX 3 旋渦混勻器（德國，IKA公司）；分析天平（精度0.0001 g，美國，OHAUS 公司）；Agilent ZORBAX SB-C18 色譜柱 （250 mm×4.6 mm，5 μm，美國，Agilent 公司）。

1.2 材料與試劑

針式過濾器（0.45 μm，尼龍66，天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）； 乙腈、 甲醇均為色譜純 （德國MERCK 公司）；水為超純水；磷酸為分析純；鞣花酸對(duì)照品（純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司）。

1.3 色譜條件

Agilent ZORBAX SB-C18 色譜柱 （250 mm×4.6 mm，5 μm）；0～20 min，0.2%磷酸∶乙腈（85∶15，體積比），等度洗脫；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量為10 μL，柱溫35 ℃；光電二極管陣列檢測器；檢測波長245 nm。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取一定量的鞣花酸對(duì)照品， 用甲醇溶解配制成質(zhì)量濃度為60 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液， 于-4 ℃避光保存。使用前，準(zhǔn)確移取適量鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液， 用甲醇配置成質(zhì)量濃度分別為1～30 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)系列工作液，于-4 ℃避光保存[10]。

1.5 樣品處理

稱取適量（精確至0.0001 g）均勻研磨的熟茶樣品于50 mL 離心管中，加入適量提取溶劑（水、25%甲醇、50%甲醇、75%甲醇、純甲醇），使料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40 和1∶50，超聲一定時(shí)間（30 min、45 min、60 min），5000 r/min 下離心10 min，取上清液于100 mL 容量瓶中，重復(fù)數(shù)次（重復(fù)0次、1 次、2 次和3 次， 即提取1 次、2 次、3 次和4次），合并上清液，用純水定容至100 mL，搖勻，過0.45 μm 水相濾膜后，待測。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效液相色譜條件優(yōu)化

使用水-甲醇、水-乙腈、磷酸水溶液-甲醇和磷酸水溶液-乙腈（磷酸濃度為0.2%、0.3%、1%）為流動(dòng)相，等度洗脫，考察不同流動(dòng)相種類、比例及pH 對(duì)普洱熟茶中鞣花酸分離效果的影響。 從目標(biāo)峰的峰形、與干擾峰的分離度等方面進(jìn)行評(píng)價(jià)。

結(jié)果表明，流動(dòng)相為水-有機(jī)相體系時(shí)，鞣花酸的色譜峰展寬、拖尾嚴(yán)重，識(shí)別困難。 在洗脫體系中加入不同濃度的磷酸進(jìn)行峰形優(yōu)化， 鞣花酸色譜峰的峰寬變窄，峰形對(duì)稱略有拖尾。但不同濃度的磷酸，對(duì)峰形變化影響不明顯，因此洗脫體系選用0.2%磷酸的濃度。 分別使用甲醇和乙腈有機(jī)相洗脫鞣花酸對(duì)照品， 發(fā)現(xiàn)乙腈洗脫體系鞣花酸的保留時(shí)間更短， 且水溶液-乙腈體積比為85∶15時(shí)樣品中鞣花酸目標(biāo)峰前后雜質(zhì)峰較少， 利于定性和定量，能顯著提高檢測效率。 因此，確定普洱熟茶中鞣花酸定量檢測的流動(dòng)相為0.2%磷酸水溶液-乙腈 （體積比為85∶15）， 保留時(shí)間為16.0 min（±0.5 min），如圖2 所示。

圖2 鞣花酸對(duì)照品和普洱熟茶樣品色譜圖Fig.2 The chromatogram of EA in reference substance and in Pu-erh ripe tea sample

2.2 樣品前處理優(yōu)化

分別研究不同料液比、不同提取液種類、不同提取時(shí)間和不同提取次數(shù)對(duì)鞣花酸提取率的影響。 在相同檢測條件下對(duì)比鞣花酸色譜峰和雜質(zhì)色譜峰（咖啡因等）的峰高或含量，從而確定最優(yōu)的前處理方法。

如圖3 所示，1∶30、1∶40、1∶50 提取組鞣花酸含量顯著低于1∶20 提取組，鞣花酸含量隨料液比降低而顯著降低，而1∶10、1∶20 提取組間鞣花酸含量無顯著差異，當(dāng)料液比為1∶10 時(shí)，咖啡因峰高超過2.0 AU，沒食子酸峰高達(dá)1.8 AU，考慮到過大響應(yīng)值可能對(duì)檢測器造成損耗，因此，1∶20 為最適料液比。

選擇水、 甲醇以及不同比例甲醇水為提取溶劑， 評(píng)價(jià)普洱熟茶中鞣花酸的提取率。 如圖4 所示，與水提取組相比，純甲醇、75%甲醇組鞣花酸提取率顯著低于水提取組，50%甲醇、25%甲醇組鞣花酸提取率低于水組，但無顯著差異，綜合考慮實(shí)驗(yàn)成本及環(huán)境污染等因素，選擇水為最適提取液。

考慮不同提取時(shí)間對(duì)普洱熟茶中鞣花酸提取率的影響。如圖5 所示，鞣花酸含量隨著提取時(shí)間的增加而增加， 但提取30 min 與提取45 min 相比無顯著差異，為提高檢測效率，確定提取時(shí)間為30 min。

考慮不同提取次數(shù)對(duì)普洱熟茶中鞣花酸提取率的影響，根據(jù)已確定的料液比（1∶20）、提取液（水）和提取時(shí)間（30 min），分別超聲提取1 次、2次、3 次和4 次。 如圖6 所示，鞣花酸含量隨著提取次數(shù)的增加而增加， 提取3 次與提取1 次和2次相比有顯著差異， 且與提取4 次相比有差異但不顯著，考慮到檢測時(shí)長和檢測效率，最終采用3次提取。

圖3 不同料液比對(duì)鞣花酸含量的影響Fig.3 Effect of different ratio of material to liquid on content of EA

圖4 不同提取液對(duì)鞣花酸含量的影響Fig.4 Effect of different extracts on content of EA

圖5 不同提取時(shí)間對(duì)鞣花酸含量的影響Fig.5 Effect of different extraction time on content of EA

圖6 不同提取次數(shù)對(duì)鞣花酸峰含量的影響Fig.6 Effect of different extraction times on peak area of EA

2.3 方法線性范圍與相關(guān)系數(shù)

采用上述所確定的方法檢測鞣花酸對(duì)照品，外標(biāo)法定量，以其峰面積為縱坐標(biāo)（y 軸），其濃度為橫坐標(biāo)（x 軸）做標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程、相關(guān)系數(shù)見表1。 在0.6～60 mg/L 范圍內(nèi)鞣花酸的線性良好。 鞣花酸的檢出限（LOD）[30]為13.5 mg/kg，定量限（LOQ）[31]為檢出限的3.33 倍，即45.0 mg/kg。

表1 鞣花酸的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 1 The Linear equation，correlation coefficient，detection and quantitative limit of EA

2.4 儀器精密度、方法重現(xiàn)性

取上述同一鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，重復(fù)進(jìn)樣6 次，進(jìn)樣量10 μL，以鞣花酸峰面積，計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.28%（n=6）。

根據(jù)“1.5”所述，按照最終確定的前處理方法進(jìn)行同一樣品平行實(shí)驗(yàn)，每個(gè)平行樣品進(jìn)樣1 次，進(jìn)樣量10 μL，以各樣品的鞣花酸含量，計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為3.7%（n=6），表明該方法重復(fù)性較好。

2.5 普洱熟茶中鞣花酸的含量

對(duì)18 個(gè)市售普洱熟茶中鞣花酸的含量進(jìn)行測定， 結(jié)果見表2。 樣品中鞣花酸含量范圍為176.6～398.1 mg/kg。

3 討論

不同普洱熟茶中鞣花素含量差異明顯。 普洱熟茶中的鞣花酸可能由茶葉中的鞣花單寧類物質(zhì)轉(zhuǎn)化而來，不同等級(jí)、不同地區(qū)的原料鞣花單寧類物質(zhì)含量不同， 且發(fā)酵程度不同也會(huì)影響普洱熟茶中鞣花酸的含量， 具體的影響因素及影響程度有待進(jìn)一步研究。

目前， 利用高效液相色譜法測定鞣花酸含量的文獻(xiàn)中，檢測對(duì)象多為水果和藥用植物，涉及普洱茶中鞣花酸含量的檢測方法鮮有報(bào)道。 部分文獻(xiàn)[32-33]中所述方法提取過程漫長、提取溶液種類復(fù)雜且環(huán)境危害較大?；蛞騼x器條件配適度較差，目標(biāo)物與雜質(zhì)峰未有效分離，導(dǎo)致定量結(jié)果不準(zhǔn)確。

文章所述方法不僅可用于普洱熟茶中鞣花酸的含量測定，也適用于普洱熟茶深加工產(chǎn)品，且為普洱熟茶發(fā)酵過程中鞣花酸變化趨勢(shì)的研究提供方法基礎(chǔ)。 現(xiàn)行大部分檢測方法使用的提取溶劑為有機(jī)試劑， 前處理包括長時(shí)間浸泡或水浴回流及濃縮、蒸干等步驟，相較于這些方法，本方法僅使用純水超聲提取，方法便捷、成本低廉、環(huán)境危害小、可批量前處理。 且方法檢測周期較短，樣品前處理2 h，比其他需要有機(jī)試劑預(yù)先浸泡數(shù)小時(shí)再提取的方法更高效。 本方法目標(biāo)峰前后雜質(zhì)峰少且較小，分離度較文獻(xiàn)方法高，可有效定量目標(biāo)峰。

表2 18 個(gè)市售普洱熟茶中鞣花酸含量（n=3）Table 2 Contents of ellagic acid in 18 commercially available Pu-erh ripe teas（n=3）