王 妍，代書景,4，佟 雷，張景陽，石學(xué)魁

(1.牡丹江醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室；2. 牡丹江醫(yī)學(xué)院藥劑學(xué)教研室；3.牡丹江市第二人民醫(yī)院肝膽外科，黑龍江 牡丹江 157011；4.新鄭市人民醫(yī)院檢驗科，河南 新鄭 451100)

熊膽粉為熊科動物黑熊(Ursus thibetanus)或棕熊(Ursus arctos)的干燥膽汁，具有清熱、平肝、明目的功能，現(xiàn)代研究證實具有保肝利膽、抗腫瘤和抗動脈粥樣硬化等藥理作用[1]。熊去氧膽酸(Ursodeoxycholic Acid,UDCA)是熊膽中游離型膽汁酸的主要成分之一，目前除藍(lán)狐膽中含有一定量的UCDA、烏蘇里貉貉膽含少量UCDA，其他動物膽汁尚未檢測到UCDA[2]。動物實驗顯示，UDCA對大鼠免疫性肝纖維化有明顯改善作用[3]；臨床研究發(fā)現(xiàn)單純熊去氧膽酸及與黃芪建中湯加減聯(lián)合均能有效地改善自身免疫性肝炎患者的肝功能及肝纖維化[4]；體外實驗研究證明UDCA可抑制人肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell,HSC)NIX蛋白的表達(dá)而發(fā)揮抗肝纖維化作用[5]。盡管UDCA臨床應(yīng)用廣泛，但其確切作用機(jī)制尚未完全明確，故本研究擬采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，分析UDCA抗肝纖維化的主要效應(yīng)機(jī)制，為深入應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 UDCA靶點預(yù)測及注釋登錄PubChem服務(wù)器(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)[6]，查詢UDCA的3D分子結(jié)構(gòu)式，下載3D分子結(jié)構(gòu)并保存為圖片格式(*.png)和SDF格式(*.sdf)文件。登錄PharmMapper服務(wù)器(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)[7]，上傳UDCA.sdf文件，獲取與UDCA相對應(yīng)的靶點蛋白。利用UniProt(https://www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫的Retrieve/ID Mapping工具[8]，對所預(yù)測的靶點蛋白進(jìn)行檢索，選擇物種為“Homo sapiens”，將蛋白的UniProt ID轉(zhuǎn)換為Gene Symbol，保存為UDCA的潛在靶點基因。

1.2 肝纖維化相關(guān)靶基因篩選以“l(fā)iver fibrosis”和“hepatic fibrosis”作為檢索詞，分別通過GeneCards(https://www.genecards.org/)和OMIM(https://omim.org/)數(shù)據(jù)庫檢索，刪除重復(fù)基因，得到肝纖維化相關(guān)基因。

1.3 UDCA對肝纖維化作用靶基因的預(yù)測將UDCA相關(guān)基因和肝纖維化相關(guān)基因?qū)朐诰€工具Venny 2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)繪制韋恩圖，獲得兩者間共同基因，即為UDCA可能作用于肝纖維化的潛在靶基因。

1.4 “藥物-靶點-疾病”可視化網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建將UDCA與肝纖維化共同靶點基因?qū)隒ytoscape 3.7.2軟件，構(gòu)建UDCA作用于肝纖維化的“藥物-靶點-疾病”的可視化網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 UDCA作用于肝纖維化的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析將UDCA作用于肝纖維化的靶點基因信息導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(http://string-db.org/)，設(shè)置物種為“Homo sapiens”，其余參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置，隱藏游離節(jié)點，建立PPI網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行分析，根據(jù)節(jié)點連接數(shù)繪圖，獲得核心基因。

1.6 UDCA對肝纖維化作用靶點GO分析和KEGG分析對UDCA作用肝纖維化靶點基因進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路富集分析，分析UDCA抗肝纖維化可能的功能及信號通路。

2 結(jié)果

2.1 UDCA相關(guān)作用靶點信息從PubChem 服務(wù)器上獲取UDCA的3D結(jié)構(gòu)(圖1)，在PharmMapper服務(wù)器上得到靶點299個，經(jīng)UniProt數(shù)據(jù)庫注釋，轉(zhuǎn)換為Gene Symbol的基因為有效基因，共篩選出66個UDCA的潛在靶點基因。

圖1 熊去氧膽酸3D結(jié)構(gòu)

2.2 肝纖維化相關(guān)靶點篩選應(yīng)用Gene Cards、OMIM數(shù)據(jù)庫全面檢索“l(fā)iver fibrosis”和“hepatic fibrosis”，去除重復(fù)，共獲得5576個肝纖維化相關(guān)基因。

2.3 UDCA作用于肝纖維化靶點的預(yù)測將UDCA相關(guān)靶點基因和Gene Cards、OMIM數(shù)據(jù)庫中獲取的肝纖維化相關(guān)靶點基因?qū)隫enny 2.1.0在線工具，取交集，獲得共同靶點基因35個，即為UDCA可能作用于肝纖維化的靶基因，得出韋恩圖(圖2)。

圖2 UDCA與肝纖維化靶點基因交集的韋恩圖

2.4 “藥物-靶點-疾病”可視化網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建將篩選出的UDCA與肝纖維化共有的35個靶點基因?qū)隒ytoscape軟件，構(gòu)建“藥物-靶點-疾病”的可視化網(wǎng)絡(luò)圖(圖3)，可以看出UDCA可通過對多靶點調(diào)控來發(fā)揮抗肝纖維化作用。

圖3 “藥物-靶點-疾病”的可視化網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 UDCA作用于肝纖維化的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析將UDCA作用于肝纖維化的35個靶點基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫獲得靶蛋白相互作用關(guān)系，并得出各靶點蛋白間相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖；剔除9個游離蛋白，共26個靶點蛋白參與了PPI網(wǎng)絡(luò)(圖4)。圖中的每一個節(jié)點(node)表示一個蛋白，連線(edge)表示蛋白之間的相互關(guān)系，與鄰接蛋白連線的數(shù)目越多，表示靶點蛋白在網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮的作用越重要，計數(shù)每個靶點和其他靶點的連線數(shù)目并作圖，得到連線≥3條的基因有8種，其中白蛋白(Albumin,ALB)的連線最多，為13條；雄激素受體(Androgen Receptor,AR)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(Matrix Metallopeptidase2,MMP2)均為5條；熱休克蛋白HSP90(Heat Shock Protein90 Alpha Family Class B Member 1,HSP90AB1)、過氧化物酶(Peroxiredoxin6,PRDX6)、小GTP酶Rac1(Rac family small GTPase 1,RAC1)均為4條；埃茲蛋白(Ezrin,EZR)、核受體亞家族3C成員2(Nuclear Receptor Subfamily 3 Group C Member 2,NR3C2)均為3條(圖5)。說明這些靶點可能在網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要作用。

圖4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖(PPI網(wǎng)絡(luò))

圖5 PPI 網(wǎng)絡(luò)核心靶點

2.6 GO分析和KEGG通路分析利用R軟件[9]對UDCA作用于肝纖維化的35個靶基因進(jìn)行GO富集分析，結(jié)果顯示，生物學(xué)功能主要涉及GTP結(jié)合、嘌呤核糖核苷結(jié)合、嘌呤核苷結(jié)合、核糖核苷結(jié)合、鳥苷酸結(jié)合、泛素蛋白連接酶結(jié)合等(圖6)。

圖6 GO富集分析

對35個靶點基因進(jìn)行KEGG通路富集分析，僅篩選出一條與UDCA抗肝纖維化密切相關(guān)的通路(P<0.05)：流體剪應(yīng)力與動脈粥樣硬化通路(圖7)。

圖7 流體剪切力與動脈粥樣硬化通路

3 討論

熊去氧膽酸單用或與其他藥物合用對多種類型肝纖維化(酒精性、非酒精性、自身免疫性、血吸蟲肝纖維化等)均有顯著的防治作用[4,9-11]。但是，肝纖維化病因復(fù)雜，目前對于UDCA抗肝纖維化的作用機(jī)制研究尚不全面；而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)注重從整體出發(fā)探索藥物與疾病之間的關(guān)系，即“藥物-基因-靶點-疾病”間復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，具有整體性、系統(tǒng)性的特點，因此本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理方法挖掘UDCA潛在作用靶點，對探究UDCA抗肝纖維化的作用機(jī)制有重要意義。

本研究通過PubChem服務(wù)器獲取UDCA的3D結(jié)構(gòu)，由PharmMapper服務(wù)器與Gene Cards、OMIM數(shù)據(jù)庫預(yù)測UDCA抗肝纖維化相關(guān)靶點基因35個。通過STRING數(shù)據(jù)庫分析，發(fā)現(xiàn)26個靶蛋白存在相互作用關(guān)系，其中ALB與鄰接蛋白的連線是13條，說明ALB很可能是UDCA發(fā)揮作用的關(guān)鍵靶點；MMP2也在蛋白互作中起重要作用。較多的研究認(rèn)為，肝纖維化由肝內(nèi)ECM(細(xì)胞外基質(zhì))的過度沉積引起，MMP2(基質(zhì)金屬蛋白酶2)在ECM降解中起關(guān)鍵作用，扶正化瘀方可能通過調(diào)控MMP2基因表達(dá)而參與ECM的降解[12]；肝纖維化的發(fā)生也與ALB蛋白異常表達(dá)有關(guān)[13]，荔枝核總黃酮可通過干預(yù)ALB等的表達(dá)發(fā)揮抗肝纖維化作用和潛在保肝作用。因此，UDCA可能是通過調(diào)節(jié)相應(yīng)作用靶點來發(fā)揮抗肝纖維化效果的。

通過“藥物-靶點-疾病”的可視化網(wǎng)絡(luò)圖，顯示UDCA可通過對多靶點調(diào)控來發(fā)揮抗肝纖維化作用。GO富集分析顯示，這些靶點與GTP結(jié)合、嘌呤核糖核苷結(jié)合、泛素蛋白連接酶結(jié)合等功能有關(guān)。KEGG通路富集分析結(jié)果提示UDCA可能通過調(diào)整流體剪應(yīng)力與動脈粥樣硬化通路發(fā)揮抗肝纖維化作用。研究顯示，肝星狀細(xì)胞(HSC)的激活可持續(xù)產(chǎn)生大量ECM，促進(jìn)肝纖維化發(fā)生、發(fā)展，而HSC又直接或間接受到血流動力學(xué)的影響發(fā)生相應(yīng)的變化，即剪切應(yīng)力的高低影響肝纖維化的發(fā)生[14]。UDCA具有中和活性氧毒性、利膽促進(jìn)膽汁酸分泌、抑制線粒體損傷和保護(hù)肝細(xì)胞等作用，抑制肝纖維化的發(fā)展[7]。

綜上所述，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法初步探究UDCA作用于肝纖維化的主要機(jī)制，為臨床應(yīng)用的有效性提供理論基礎(chǔ)。由于本研究是基于網(wǎng)絡(luò)平臺、數(shù)據(jù)庫所做的預(yù)測，研究結(jié)果具有一定的局限性，尚需進(jìn)一步通過實驗研究加以驗證其有效性與可靠性。