趙珈華，李玉婷，劉 洋，桂金秋，李亞彤，石學(xué)魁，唐小云

(牡丹江醫(yī)學(xué)院 1.病原生物學(xué)教研室；2.病原生物學(xué)實(shí)驗室，黑龍江 牡丹江 157011)

黃芪是豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的成熟干燥根莖，是東北地區(qū)道地藥材，其性味甘、微溫，歸脾、肺經(jīng)，具有補(bǔ)氣健脾的功效，被稱為“補(bǔ)藥之長”[1-2]。黃芪含有豐富的皂苷類、黃酮類，以及多糖類成分[3]。目前對于黃芪活性成分研究居多，但對于黃芪多糖對超敏反應(yīng)影響機(jī)制的研究尚少。研究表明，多糖具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、降血脂等生物活性，且無毒、無抗藥性作用[4-6]。因此本文探討黃芪多糖(Astragalus polysaccharide，APS)對遲發(fā)型超敏反應(yīng)(Delayed-type hypersensitivity，DTH)小鼠的影響，觀察黃芪多糖對DTH模型小鼠腸道菌群的影響。

1 材料與方法

1.1 主要儀器Bio-Rad S100PCR自動系列化分析儀(Bio-Rad)，ABI 7500實(shí)時熒光定量PCR儀(Thermo Fisher)，Sigma 3K15臺式高速冷凍離心機(jī)(Sigma)，XS-104精密電子分析天平(METTLER TOLEDO)。

（2）進(jìn)行電氣設(shè)備配管下料時，必須要由專業(yè)的監(jiān)理工程師進(jìn)行施工監(jiān)督，且施工的整個過程，都需要按照施工規(guī)范與設(shè)計規(guī)范進(jìn)行相應(yīng)施工，施工時若發(fā)現(xiàn)下料的材料不符合質(zhì)量要求，必須進(jìn)行更換，以確保電氣設(shè)備的質(zhì)量與安全性。

1.2 主要藥品與試劑APS購于西安瑞林生物科技有限公司，批號：HQC210416，純度>90%；DNFB購于西亞化學(xué)科技(山東)有限公司，批號A48120，分析純；醋酸地塞米松片，安徽金太陽生化藥業(yè)有限公司(批號：國藥準(zhǔn)字H34021845)；總RNA提取試劑盒購于索萊寶科技有限公司；cDNA第一鏈合成試劑盒購于碧云天生物技術(shù)有限公司；Oxoid酵母粉購于上海根生生物科技有限公司；無菌均質(zhì)袋、2.5 L厭氧產(chǎn)氣包、伊紅美蘭培養(yǎng)基瓊脂、糞腸球菌培養(yǎng)基瓊脂、乳酸桿菌培養(yǎng)基瓊脂、雙歧桿菌培養(yǎng)基瓊脂均購于青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗動物SPF級ICR小鼠，50只，6～8周齡，雄性，體質(zhì)量(20±2)g，由牡丹江醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心提供，在溫度為(24±2)℃ 無菌的SPF動物房飼養(yǎng)，晝夜光照12 h, 自由飲水和標(biāo)準(zhǔn)的小鼠飼料。本研究已取得牡丹江醫(yī)學(xué)院動物福利與倫理委員會批準(zhǔn)。

診斷與納排標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）使用含替諾福韋的方案治療后出現(xiàn)腎損傷；（2）符合藥物不良反應(yīng)關(guān)聯(lián)性評價。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）糖尿病腎病、人類免疫缺陷病毒 （HIV）相關(guān)性腎病和高血壓腎病人群；（2）其他藥物導(dǎo)致的腎損傷。

本部分首先使用現(xiàn)實(shí)數(shù)據(jù)對本文構(gòu)建的包含耐用品部門與非耐用品部門的基準(zhǔn)模型進(jìn)行校準(zhǔn)與貝葉斯估計，在此基礎(chǔ)上，分析模型的動態(tài)特征并考察耐用品部門對貨幣政策動態(tài)效應(yīng)產(chǎn)生的影響。

1.4.3 脾指數(shù)的計算 致敏24 h后稱重小鼠，頸椎脫臼處死，取脾稱重。脾指數(shù)(mg/g)=脾質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)。

1.4.1 實(shí)驗動物造模及分組 將50只SPF級ICR小鼠隨機(jī)分為NC組、MC組、DEX組、APS-L組以及APS-H組，每組10只。在常規(guī)飲食飲水的基礎(chǔ)上，各組小鼠背部脫毛2 cm2，其中MC組、DEX組、APS-L組以及APS-H組小鼠給予0.7%DNFB(溶于丙酮：橄欖油1∶1)85 μL背部激發(fā)造模，連續(xù)2 d，而NC組背部脫毛后給予等量丙酮橄欖油涂抹。激發(fā)當(dāng)日DEX組、APS-L組、APS-H組分別以地塞米松2.5 mg/(kg·d)、APS 200 mg/(kg·d)、APS 400 mg/(kg·d)灌胃0.2 mL，NC組和MC組以等量無菌三蒸水灌胃，1次/d，連續(xù)7 d。末次給藥30 min后，DEX組、APS-L組、APS-H組和MC組用微量移液器吸取0.7%DNFB 20 μL，均勻滴加于小鼠右耳前后兩面致敏，同時左耳涂抹等量丙酮橄欖油溶液作為對照，NC組僅右耳前后涂抹等量丙酮橄欖油，左耳不做處理。致敏24 h后處死小鼠采集標(biāo)本進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測。

2.2 黃芪多糖對DTH模型小鼠脾指數(shù)的影響MC組與NC組比較，脾指數(shù)明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.0001)；APS-L組和APS-H組與MC組比較，脾指數(shù)均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；DEX組與MC組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明APS對DTH引起的炎癥反應(yīng)有明顯的抑制作用，APS-L組與APS-H組之間無明顯統(tǒng)計學(xué)差異，見表4。

1.4 實(shí)驗方法

“哎喲，不錯嘛，你們說的這兩句詩分別出自于白居易的詩歌《問劉十九》和《別氈帳火爐》。除此之外，在《即事重題》等詩歌里他也提到過爐子。”

水權(quán)所有者擁有的水權(quán)，是其合法擁有的資產(chǎn)，只要不違反水權(quán)使用、交易的相關(guān)法規(guī)，其水權(quán)就受法律保護(hù)而不能受他人侵害，也不能被政府剝奪。

2.1 黃芪多糖對DTH模型小鼠耳腫脹度的影響MC組小鼠耳腫脹度與NC組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.0001)；與MC組比較，APS-L組和APS-H組小鼠耳腫脹度明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.0001)，說明APS對DNFB所致DTH有明顯的緩解作用。APS-L組與APS-H組之間無明顯統(tǒng)計學(xué)差異，見表4。

表1 腸道細(xì)菌培養(yǎng)基和稀釋度的選擇及相關(guān)培養(yǎng)條件

2.4 黃芪多糖對DTH模型小鼠腸道菌群的影響伊紅美蘭培養(yǎng)基瓊脂、糞腸球菌培養(yǎng)基瓊脂、乳酸桿菌培養(yǎng)基瓊脂、雙歧桿菌培養(yǎng)基瓊脂，分別用于大腸桿菌、糞腸球菌、乳酸桿菌和雙歧桿菌的培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與NC組相比較，MC組小鼠腸道大腸桿菌和糞腸球菌數(shù)量明顯增加，雙歧桿菌和乳酸桿菌數(shù)量明顯減少，差異具有顯著性差異(P<0.001)。與MC組相比較，APS-L組和APS-H組的乳酸桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量均明顯增加，具有顯著性差異(P<0.0001)，APS-L組和APS-H組大腸桿菌均明顯減少，具有顯著性差異(P<0.0001)。詳情見表5。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析采用Graphpad Prism 8.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,實(shí)驗數(shù)據(jù)以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，多組間的比較采用單因素方差分析，并進(jìn)行多重比較，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

表2 實(shí)時熒光定量PCR引物序列

表3 實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)體系

2 結(jié)果

從圖8a可以看出,在眼壁區(qū)域內(nèi),沒有反氣旋性輻散和正變高相匹配,也沒有氣旋性輻合和負(fù)變高項匹配,說明眼壁區(qū)域沒有表現(xiàn)出渦旋Rossby波的特征。在眼壁區(qū)域外,也沒有輻合(散)區(qū)和反氣旋(氣旋)區(qū)重疊,即眼壁外側(cè)也沒有表現(xiàn)出重力波的特征。說明內(nèi)雨帶的發(fā)展和混合波也是沒有關(guān)系的。

1.4.4 HE染色 取各組小鼠相同位置耳組織，用4%中性甲醛固定，石蠟包埋，6 μm切片，HE染色，光鏡觀察耳片病理學(xué)變化情況，獲取切片圖像。

表4 黃芪多糖對DTH小鼠的治療作用

1.4.2 耳腫脹度的計算 頸椎脫臼處死小鼠，分別剪下雙耳，對齊雙耳用8 mm打孔器在相同部位打下圓耳片，稱質(zhì)量，左、右耳片質(zhì)量差為其腫脹度。

圖1 各組小鼠耳組織病理學(xué)變化(×100)

2.3 黃芪多糖對DTH模型小鼠耳組織形態(tài)學(xué)影響將耳片組織固定并進(jìn)行HE 染色，結(jié)果如圖1所示，NC組耳組織結(jié)構(gòu)正常、分層清晰，MC組小鼠毛囊結(jié)構(gòu)減少、真皮層大量炎癥細(xì)胞浸潤；APS能緩解表皮損傷，水腫程度減輕，炎癥細(xì)胞浸潤減少，其中APS-H組效果和DEX組相近。

1.4.6 實(shí)時熒光定量PCR 使用總RNA提取試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)從脾臟組織中分離總RNA。然后使用cDNA第一鏈合成試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。利用FastStart Universal SYBR Green Master(ROX) Kit(Roche公司)通過引物序列進(jìn)行擴(kuò)增。引物設(shè)計見表2。反應(yīng)體系見表3。反應(yīng)條件如下：總反應(yīng)體系 20 μL，95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火60 s，72 ℃延伸30 s。進(jìn)行40個循環(huán)。每個樣品重復(fù)3次，依據(jù)2-△△CT法計算各樣本mRNA的相對表達(dá)量。GAPDH為內(nèi)參基因。

表5 黃芪多糖對DTH模型小鼠腸道菌群的調(diào)節(jié)作用

2.5 黃芪多糖對DTH 模型小鼠脾臟中IFN-γ mRNA表達(dá)的影響如表6所示，MC組同NC組比較，IFN-γ的mRNA表達(dá)呈現(xiàn)升高趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.0001)；與MC組相比，APS-L組和APS-H組IFN-γ的mRNA表達(dá)呈現(xiàn)下降趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.0001)，APS-L組與APS-H組之間存在明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.0001)。說明APS可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)實(shí)現(xiàn)對機(jī)體免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用，其中高劑量APS的效果更佳。

表6 黃芪多糖對DTH 模型小鼠脾臟中IFN-γ mRNA表達(dá)的影響

3 討論

二硝基氟苯屬于一種半抗原，其誘導(dǎo)的IV型超敏反應(yīng)是由T細(xì)胞介導(dǎo)的以單個核細(xì)胞浸潤和組織損傷為主要特征的炎癥反應(yīng)，也稱作接觸性過敏反應(yīng)，是指抗原進(jìn)入機(jī)體使T細(xì)胞致敏，當(dāng)再次接觸相同致敏原后，特異性T淋巴細(xì)胞釋放炎性因子，引起炎癥反應(yīng)。本實(shí)驗結(jié)果顯示：與NC組比較，MC組小鼠耳腫脹度與脾指數(shù)明顯增高，細(xì)胞因子IFN-γ的mRNA表達(dá)也有所提高。由此可見DTH模型小鼠制備成功。

脾臟是機(jī)體最大的免疫器官，也是免疫反應(yīng)的主要場所，可以清除機(jī)體內(nèi)衰老細(xì)胞和微生物等物質(zhì)，脾臟中大量T細(xì)胞、B細(xì)胞及巨噬細(xì)胞在機(jī)體免疫防御和清除功能中起到重要作用。因此測定脾臟指數(shù)可以反映機(jī)體的免疫功能狀態(tài)。本實(shí)驗中，與MC組相比，APS-L組與APS-H組的脾臟指數(shù)均顯著下降，其結(jié)果顯示機(jī)體淋巴細(xì)胞損傷或凋亡，說明APS可下調(diào)DTH 模型小鼠細(xì)胞免疫功能。此外，APS可顯著降低小鼠的耳腫脹度，說明APS對機(jī)體的炎癥反應(yīng)具有抑制作用。

IFN-γ是典型的Th1型細(xì)胞因子，是炎癥因子家族的成員之一，可以促進(jìn)粘附分子的表達(dá)從而加重炎癥反應(yīng)程度[7]。Wakabayashi[8]經(jīng)過研究證實(shí)在DTH模型小鼠炎癥組織中IFN-γ的mRNA高表達(dá)，表明IFN-γ在DTH病程中起到重要作用。本實(shí)驗中，MC組的IFN-γ mRNA與NC組相比，呈高表達(dá)，這與Wakabayashi 的研究結(jié)果一致。此外本實(shí)驗表明APS可顯著降低DTH模型小鼠脾臟中IFN-γ的mRNA表達(dá)，說明APS可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子IFN-γ的mRNA表達(dá)實(shí)現(xiàn)對機(jī)體免疫系統(tǒng)的抑制作用。

近年來腸道菌群成為多個學(xué)科研究的熱點(diǎn)，不僅僅限于對腸道內(nèi)疾病的影響，更多的是對腸道外疾病的影響，比如內(nèi)分泌代謝疾病中的糖尿病[9]、精神障礙疾病中的抑郁癥[10]等，腸道菌群微生態(tài)失調(diào)可能對許多疾病的病理進(jìn)程都起著重要作用。本實(shí)驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)與NC組相比較，MC組小鼠腸道大腸桿菌和糞腸球菌數(shù)量明顯增加，雙歧桿菌和乳酸桿菌數(shù)量明顯減少，由此可見，DNFB誘導(dǎo)的IV型超敏反應(yīng)模型小鼠腸道菌群出現(xiàn)失調(diào)。經(jīng)黃芪多糖給藥7 d后，腸道內(nèi)雙歧桿菌和乳酸桿菌數(shù)量明顯增多，腸桿菌和腸球菌數(shù)量減少，說明黃芪多糖可改善DNFB誘導(dǎo)的IV型超敏反應(yīng)模型小鼠腸道菌群。

綜上所述，黃芪多糖通過抑制細(xì)胞因子IFN-γ的mRNA表達(dá)和調(diào)節(jié)腸道菌群達(dá)到抑制DTH小鼠免疫反應(yīng)，黃芪多糖高劑量組能較好地減輕DTH并改善DTH模型小鼠的腸道菌群。黃芪多糖抑制IFN-γ mRNA表達(dá)及調(diào)節(jié)腸道菌群的機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。