梁家瑋，郭海峰

(1.牡丹江醫(yī)學(xué)院；2.牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院，黑龍江 牡丹江 157011)

三陰性乳腺癌(Triple-negative breast cancer,TNBC)具有雌激素受體(Estrogen receptor,ER)、孕激素受體(Progesterone receptor,PR)和人表皮生長(zhǎng)因子受體2(Human epidermal growth factor receptor-2 extracellular domain,HER2)陰性表達(dá)的特殊分子表型[1]。鑒于這種特殊表型，TNBC對(duì)內(nèi)分泌治療和靶向治療均不敏感，常規(guī)術(shù)后輔助放化療而殘留的轉(zhuǎn)移病灶最終會(huì)導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)，5年內(nèi)死亡率可高達(dá)40%[2-3]。故迫切需要開發(fā)針對(duì)TNBC的新的治療方案和靶點(diǎn)。金屬硫蛋白1E(Metallothionein1E,MT1E)是一種富含半胱氨酸的非酶類小分子蛋白，是人金屬硫蛋白(Metallothionein,MT)的亞型之一，其可由多種內(nèi)源和/或外源性刺激誘導(dǎo)表達(dá)，在多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中扮演重要角色[4]。本研究通過免疫組化SP法對(duì)人TNBC組織和癌旁組織中的MT1E表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，并進(jìn)一步分析其與TNBC患者臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集自2015年1月至2016年12月間于牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院治療的45例TNBC患者的TNBC組織和癌旁組織，并制作成石蠟切片。45名患者均為女性，年齡29～79歲，中位年齡56歲，平均年齡(51.87±11.00)歲，資料均來自臨床入院病歷。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者均行乳腺癌改良根治術(shù)+前哨淋巴結(jié)活檢術(shù)(陽性者進(jìn)行腋窩淋巴結(jié)清掃)，所有患者術(shù)前均未接受放療、化療和靶向治療等。排除標(biāo)準(zhǔn)：臨床或病理資料不可獲得者；合并其它惡性腫瘤者；術(shù)前存在其它臟器轉(zhuǎn)移者；未按乳腺癌治療指南行術(shù)后輔助治療者。所有使用標(biāo)本均符合倫理委員會(huì)要求并簽署知情同意書。

1.2 免疫組織化學(xué)染色SP法檢測(cè)MT1E表達(dá)

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色SP法 (1)烤片：石蠟切片60 ℃恒溫箱烤片1 h；(2)脫蠟至水：依次在二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中浸泡 20 min，無水乙醇、95% 乙醇、85%乙醇和 75% 乙醇內(nèi)各浸泡5 min，最后用PBS清洗切片；(3)抗原修復(fù)：切片上滴加檸檬酸緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)后用PBS溶液進(jìn)行5 min×3次的清洗；(4)阻斷內(nèi)源性過氧化物酶：切片置入3%雙氧水后室溫避光孵育20 min，PBS溶液進(jìn)行5 min×3次的清洗；(5)血清封閉: 切片甩干后用組化筆畫圈，在組化圈內(nèi)滴加3%BSA均勻覆蓋組織，室溫封閉20 min；(6)加一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加配好的一抗溶液，置于濕盒內(nèi)4°C孵育過夜；(7)滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液，37 ℃孵育1 h后PBS溶液進(jìn)行5 min×3次的清洗；(8)滴加SP工作液，37 ℃孵育1 h后PBS溶液進(jìn)行5 min×3次的清洗；(9)DAB顯色5 min、蘇木精復(fù)染2 min，常規(guī)脫水、透明、封片后鏡檢。兔抗人MT1E一抗購(gòu)自上海澤葉生物技術(shù)有限公司(ZY-6074)，按1∶100比例稀釋。

1.2.2 結(jié)果判讀 采用半定量法進(jìn)行結(jié)果分析。(1)按細(xì)胞著色程度評(píng)分：不著色者0分，著色弱、淺黃色者1分，著色中等、棕黃色者2分，著色強(qiáng)、棕褐色者3分。(2)按陽性細(xì)胞占比評(píng)分：無陽性細(xì)胞者記0分，1%～25%者記1分，26%～50%者記2分，51%～75%者記3分，≥76%者記4分。(3)兩項(xiàng)得分相乘:0分為陰性，1～3分為弱陽性，4～8分為陽性，9～12為強(qiáng)陽性。最終得分0～3視為低表達(dá)，4～12視為高表達(dá)。

1.3 隨訪和預(yù)后分析隨訪方式涵括住院復(fù)查、門診和電話隨訪。隨訪起始于術(shù)后第一天，每3個(gè)月一次，截止時(shí)間點(diǎn)為2020年6月30日。總生存期(Overall survival,OS)為患者術(shù)后第一日起至因TNBC引起死亡的時(shí)間，無病生存期(Disease-free survival,DFS)為患者術(shù)后第一日起至TNBC出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的時(shí)間，對(duì)中途失訪、死于其它疾病和生存期超過隨訪截止時(shí)間的數(shù)據(jù)視為刪失數(shù)據(jù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法以SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。Kaplan-Meier曲線法用以進(jìn)行MT1E表達(dá)相關(guān)的預(yù)后分析。Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析與患者DFS和OS相關(guān)的臨床病理特征，因該研究樣本總數(shù)偏少、變量多，先通過單因素分析篩選出可能相關(guān)的變量后再行多因素分析。P<0.05代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者隨訪信息患者的隨訪時(shí)間為23～63個(gè)月，中位隨訪時(shí)間為49個(gè)月，其中41例完成隨訪，4例失訪，失訪率為8.9%；至隨訪截止，出現(xiàn)TNBC復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的患者共15例，其中11例因腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移死亡，死于其他原因者4例。

圖1 MT1E在TNBC組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織中表達(dá)的代表性圖片(×400)

2.2 MT1E在TNBC組織及癌旁組織中的表達(dá)免疫組織化學(xué)染色SP法結(jié)果顯示，MT1E陽性定位于細(xì)胞質(zhì)，見圖1。TNBC組織中MT1E的高表達(dá)率高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 MT1E在TNBC組織和癌旁組織中的表達(dá)

2.3 TNBC中MT1E表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系臨床病理特征資料均來自臨床入院病歷及術(shù)后病理報(bào)告。MT1E高表達(dá)與患者年齡、絕經(jīng)與否和腫瘤大小無關(guān)(P>0.05)；但與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期和組織學(xué)分級(jí)有關(guān)(P<0.05)。MT1E表達(dá)水平越高TNBC的惡性程度越高，發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移等惡性事件的可能越大，見表2。

表2 MT1E與TNBC臨床病理特征的關(guān)系

2.4 MT1E表達(dá)與TNBC預(yù)后的相關(guān)性Kaplan-Meier法進(jìn)行MT1E表達(dá)與TNBC預(yù)后相關(guān)性的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，MT1E高表達(dá)和低表達(dá)患者的無病生存曲線和總生存曲線分別見圖2、圖3。MT1E高表達(dá)組的累積無病生存率為45.5%，低表達(dá)組的累積無病生存率為68.0%，MT1E高表達(dá)組的累積無病生存率顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；MT1E高表達(dá)組的累積總生存率為53.6%，低表達(dá)組的累積總生存率為75.4%；MT1E高表達(dá)組的累積總生存率顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。上述結(jié)果提示MT1E高表達(dá)組的TNBC患者較低表達(dá)組更容易出現(xiàn)復(fù)發(fā)和死亡等惡性事件且時(shí)間較早。

圖2 MT1E表達(dá)與患者無病生存率的關(guān)系

圖3 MT1E表達(dá)與患者總生存率的關(guān)系

2.5 影響TNBC患者DFS和OS的臨床病理特征經(jīng)單因素分析后分別將MT1E表達(dá)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期納入DFS的多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型，MT1E表達(dá)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期和病理學(xué)分級(jí)納入OS的多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型。多因素分析結(jié)果提示TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和MT1E表達(dá)與TNBC的復(fù)發(fā)相關(guān)，而TNM分期和MT1E表達(dá)與TNBC的死亡相關(guān)。推測(cè)MT1E表達(dá)可作為預(yù)測(cè)TNBC復(fù)發(fā)和死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。見表3和表4。

表3 TNBC患者臨床病理特征與DFS的單因素和多因素COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析

表4 TNBC患者臨床病理參數(shù)與OS的單因素和多因素COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析

3 討論

乳腺癌的分子亞型主要由免疫組織化學(xué)的方式進(jìn)行確定。TNBC具有ER、PR和HER-2表達(dá)缺失的分子表型，但作為一種異質(zhì)性疾病，其基因組和轉(zhuǎn)錄組譜等方面都表現(xiàn)出巨大差異[5]。TNBC的這種異質(zhì)性致使很難在臨床前研究中找到合適的分子靶點(diǎn)，無法研發(fā)針對(duì)整個(gè)TNBC的藥物，使其主要治療方法仍然停留在蒽環(huán)類和紫杉醇類化療。雖然新輔助化療的臨床治療效果明顯，但與其他乳腺癌亞型相比TNBC患者的遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)率仍然更高，預(yù)后更差，生存期明顯短于其它乳腺癌亞型[6]。因此，除了開發(fā)舊藥的新用途外，不斷尋找新的有效的治療靶點(diǎn)逐漸成為TNBC治療重點(diǎn)。

MT是一種分子量低約6～7kDa的、由61～68個(gè)氨基酸組成的、高度保守的、富含半胱氨酸的小分子蛋白，其對(duì)正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的增殖、分化和凋亡發(fā)揮了至關(guān)重要的影響[7]。MT在生物學(xué)中最初被認(rèn)定的功能便是與金屬離子(鋅和鎘等)的結(jié)合、轉(zhuǎn)運(yùn)和調(diào)控，這項(xiàng)功能使其可調(diào)控許多與腫瘤相關(guān)的鋅依賴性蛋白的合成，對(duì)腫瘤的細(xì)胞分化與增殖、血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移起重要作用，并作為調(diào)節(jié)金屬穩(wěn)態(tài)的免疫調(diào)節(jié)劑對(duì)腫瘤微環(huán)境進(jìn)行重塑使腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸。同時(shí)，MT還可作為抗氧化劑保護(hù)腫瘤細(xì)胞免受由誘變劑、抗腫瘤藥和輻射產(chǎn)生的自由基和氧化應(yīng)激的影響，并對(duì)DNA損傷和細(xì)胞凋亡起到保護(hù)作用[8]。盡管MT在不同腫瘤組織中表達(dá)水平具有差異，但這恰恰說明了MT在腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展中扮演重要角色[9]。

MT1E是MT的亞型之一，F(xiàn)riedline[10]、Jin[11]以及Tai[13]均發(fā)現(xiàn)，相較雌激素受體陽性乳腺癌，MT1E在雌激素陰性受體的乳腺癌中表達(dá)更高，MT1E可能在雌激素受體陰性的乳腺癌中具有獨(dú)特的生物學(xué)作用。本研究通過免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)TNBC組織中MT1E的表達(dá)高于癌旁組織，且MT1E的表達(dá)與TNBC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、組織學(xué)分級(jí)等臨床病理特征，并影響著TNBC的復(fù)發(fā)、患者的死亡等預(yù)后狀況。由此可見，MT1E在TNBC中扮演著促進(jìn)其生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移的角色，其可能作為調(diào)控因子直接或間接調(diào)控靶向TNBC的部分腫瘤基因的表達(dá)進(jìn)而參與TNBC的發(fā)生和發(fā)展中。

綜上所述，MT1E可能在TNBC等多種腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展中扮演重要的角色。雖然本研究樣本量較小且僅采用免疫組織化學(xué)染色的實(shí)驗(yàn)方法分析了MT1E在TNBC中的表達(dá)和作用，但明顯可見MT1E在TNBC中具有很高的科研價(jià)值。相信通過對(duì)MT1E與TNBC的深入研究，不僅可揭示其在TNBC發(fā)病機(jī)制中的功能，還將為TNBC診斷和治療提供新的見解。