劉金麗，秦福霞，杜 鵑，楊 月，劉 野，王紅艷，郭素芬

(牡丹江醫(yī)學(xué)院病理教研室，黑龍江 牡丹江 157011)

隨著現(xiàn)代社會(huì)的快速發(fā)展，環(huán)境問(wèn)題、基因突變、遺傳因素等導(dǎo)致腫瘤發(fā)病日趨嚴(yán)重，而對(duì)于女性來(lái)講，乳腺癌已經(jīng)成為高發(fā)癌癥之一，且有逐年增長(zhǎng)之趨勢(shì)，目前針對(duì)乳腺癌的發(fā)病機(jī)制研究漸漸成熟，但乳腺癌的轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)仍然是乳腺癌治療中一個(gè)難題[1]，LncRNA OIP5-AS1是從編碼OIP5的同一基因的反義方向轉(zhuǎn)錄的，OIP5-AS1是一種與腫瘤密切相關(guān)的LncRNA[2]，大量研究發(fā)現(xiàn)其不僅在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的早期發(fā)育中起關(guān)鍵作用，而且在惡性腫瘤的進(jìn)展過(guò)程中起到復(fù)雜的細(xì)胞調(diào)控作用[3]。它不僅抑制細(xì)胞周期蛋白G相關(guān)激酶的表達(dá)從而影響有絲分裂，而且在許多腫瘤中也調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡[4]，包括肺腺癌[5]、膠質(zhì)瘤[6]和肝母細(xì)胞瘤[7]等。但是LncRNA OIP5-AS1在人類(lèi)乳腺癌中的功能還需進(jìn)一步的探索[8]。我們課題組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：乳腺癌細(xì)胞中的Linc-OIP5被干擾后能夠調(diào)節(jié)與其共培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞管腔形成，并抑制其增殖與遷移，這表明該因子與腫瘤血管形成密切相關(guān)[9]，然而LncRNA OIP5-AS1能否成為防治乳腺癌轉(zhuǎn)移的潛在靶基因？這些問(wèn)題的解決對(duì)臨床治療乳腺癌具有重要參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑胎牛血清(上海生工生物工程有限公司)；人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院北京細(xì)胞庫(kù))；LncRNA OIP5-AS1及內(nèi)參引物(上海生工生物工程有限公司)；轉(zhuǎn)染試劑(武漢金拓思生物科技有限公司)，LncRNA OIP5-AS1 siRNA、NC siRNA(武漢金拓思生物科技有限公司)；BCA蛋白濃度試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)；E-Cadherin兔多克隆抗體及Vimentin兔多克隆抗體和山羊抗兔二抗(碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞6×105個(gè)均勻鋪于6孔板中，置于恒溫?zé)o菌箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度達(dá)到70%左右時(shí)進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染。LncRNA OIP5-AS1 siRNA、NC siRNA質(zhì)粒具體轉(zhuǎn)染操作按轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。轉(zhuǎn)染12 h后，收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染LncRNA OIP5-AS1 siRNA的MDA-MB-231細(xì)胞，記為L(zhǎng)ncRNA OIP5-AS1 siRNA組，轉(zhuǎn)染NC siRNA后的MDA-MB-231細(xì)胞記為NC siRNA組，未作任何處理的MDA-MB-231細(xì)胞記為Control組。

1.2.2 RT-qPCR檢測(cè) LncRNA OIP5-AS1的基因表達(dá)水平 依據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)提取各組細(xì)胞RNA后，選取 20 μL 體系，進(jìn)行 cDNA 的合成。之后，以 cDNA 為模板進(jìn)行擴(kuò)增qRT-PCR，設(shè)置的反應(yīng)條件為：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s， 72 ℃ 10 min) 連續(xù)40次循環(huán)，4 ℃冰上保存。引物序列見(jiàn)表1。

表1 RT-qPCR引物擴(kuò)增序列

1.2.3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 細(xì)胞計(jì)數(shù)后均勻鋪于6孔板內(nèi)，待細(xì)胞處于單層融合貼壁狀態(tài)后，各組細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)，使用相同大小的槍頭分別進(jìn)行細(xì)胞劃痕；緩沖液沖洗2次，目的是洗掉細(xì)胞碎片。并且分別在培養(yǎng)0 h、24 h后，記錄鏡下劃痕的變化情況，而后對(duì)不同組別劃痕面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.4 Western blots檢測(cè)E-cadherin及Vimentin蛋白表達(dá)水平 提取總蛋白后進(jìn)行蛋白定量測(cè)定，配制8% SDS-PAGE 凝膠，凝膠電泳條件為80 V直至蛋白到達(dá)底部；100 mA進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉37 ℃環(huán)境封閉2 h，加入相應(yīng)一抗稀釋液(E-cadherin稀釋濃度為1∶5000，Vimentin稀釋濃度為1∶2000)，4 ℃搖床過(guò)夜。于第2日，TBST洗掉多余未結(jié)合的一抗，每次 10 min。加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(稀釋濃度為1∶5000)，室溫?fù)u床1 h，TBST洗去多余未結(jié)合的二抗，每次10 min。ECL顯色液A液(魯米諾)與B液(過(guò)氧化物)按等比例混合，配置顯影劑1 mL。采用ImageJ 153軟件進(jìn)行灰度值分析[10]。

1.2.5 LncRNA OIP5-AS1干擾后Notch1 mRNA的表達(dá)水平 按上述方法轉(zhuǎn)染并提取各組細(xì)胞的RNA，以RT-qPCR方法檢測(cè)。引物序列見(jiàn)表1。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用GraphpadPrism 8軟件對(duì)此次實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析與比較，計(jì)量數(shù)據(jù)采用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，兩組間數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析t檢驗(yàn)，當(dāng)P值小于0.05時(shí)，我們認(rèn)為此種差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231轉(zhuǎn)染LncRNAOIP5-AS1 siRNA后的干擾效果各組數(shù)據(jù)顯示，在與陰性對(duì)照組比較時(shí)，干擾36 h后，LncRNA OIP5-AS1的表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)見(jiàn)表2。

表2 LncRNA OIP5-AS1干擾后LncRNA OIP5-AS1的mRNA表達(dá)水平的變化

2.2 各組細(xì)胞遷移能力通過(guò)觀察24 h細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果，與對(duì)照組相比，LncRNA OIP5-AS1干擾組遷移能力受到抑制(P<0.01)，見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 劃痕光鏡圖(×100)

圖2 LncRNA OIP5-AS1干擾后細(xì)胞遷移率的變化

2.3 E-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)水平與NC siRNA對(duì)照組比較，干擾LncRNA OIP5-AS1后乳腺癌細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)水平升高、Vimentin蛋白表達(dá)水平降低，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，這說(shuō)明EMT的發(fā)展得到抑制，見(jiàn)圖3、圖4。

圖3 LncRNA OIP5-AS1干擾后E-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)

圖4 LncRNA OIP5-AS1干擾后檢測(cè)E-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)水平

2.4 Notch1的mRNA表達(dá)水平Notch1的RT-qPCR法檢測(cè)結(jié)果顯示：與空白組及NC siRNA組比較，LncRNA OIP5-AS1 siRNA組乳腺癌細(xì)胞中Notch1 mRNA的表達(dá)明顯降低，而空白組與NC siRNA組中Notch1 mRNA的表達(dá)水平并無(wú)明顯差異，這些說(shuō)明靶向調(diào)控乳腺癌細(xì)胞中LncRNA OIP5-AS1的表達(dá)與Notch1表達(dá)水平有密切的關(guān)系，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表A。

表4 LncRNA OIP5-AS1干擾后Notch1表達(dá)水平的變化 化

3 討論

乳腺癌治療過(guò)程中發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的問(wèn)題依舊是乳腺癌治療所面臨的巨大挑戰(zhàn)，本研究利用具有高侵襲特性的人乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞為研究對(duì)象，研究了lncRNA OIP5-AS1在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的可能作用，我們通過(guò)siRNA技術(shù)干擾lncRNA OIP5-AS1在乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中的表達(dá)，從而觀察其對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化及Notch1表達(dá)的影響，旨在發(fā)現(xiàn)調(diào)控乳腺癌不斷發(fā)展的重要因素。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示干擾該基因可以成功抑制乳腺癌細(xì)胞部分生物學(xué)行為，這一結(jié)果對(duì)于尋找新的抑制乳腺癌潛在靶點(diǎn)是一種重要的提示。

細(xì)胞遷移是腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的前提條件，本實(shí)驗(yàn)在lncRNA OIP5-AS1被干擾后，乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞遷移能力受到抑制，這說(shuō)明lncRNA OIP5-AS1可以促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的遷移。

EMT過(guò)程是腫瘤獲得遷移能力促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的重要環(huán)節(jié)，在發(fā)生EMT的過(guò)程中，上皮細(xì)胞失去極性，細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，最終導(dǎo)致細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性增強(qiáng)，這是腫瘤細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)的根源[11]，EMT過(guò)程的顯著特征在于E-cadherin表達(dá)下降、Vimentin表達(dá)上升，使細(xì)胞極性降低[12]。在本次實(shí)驗(yàn)中我們采用Westen blots技術(shù)研究了沉默lncRNAOIP5-AS1后，E-cadherin與Vimentin的表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在沉默lncRNA OIP5-AS1的同時(shí)，E-cadherin表達(dá)上升，而Vimentin表達(dá)下降，這種變化恰與EMT過(guò)程相反，這一結(jié)論也提示我們沉默lncRNA OIP5-AS1后抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的遷移能力受到抑制，可能與抑制EMT過(guò)程密切相關(guān)。

大量研究表明Notch1在很多種癌癥中表達(dá)上調(diào)。當(dāng)降低了Notch1的表達(dá)時(shí)，可同時(shí)抑制癌細(xì)胞的Notch配體，Notch信號(hào)通路被激活的閾值有所提高，從而使Notch的大部分受體被活化的過(guò)程受到抑制，進(jìn)而導(dǎo)致進(jìn)入細(xì)胞核募集與遷移相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子啟動(dòng)相關(guān)蛋白的表達(dá)受到抑制。因此，為了研究LncRNA OIP5-AS1與 Notch1表達(dá)的關(guān)系，在本實(shí)驗(yàn)中我們通過(guò)qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)了干擾lncRNA OIP5-AS1后Notch1 mRNA的表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在干擾lncRNA OIP5-AS1基因的同時(shí)，Notch1 mRNA的表達(dá)下調(diào)，這說(shuō)明lncRNA OIP5-AS1的上述作用可能與Notch1表達(dá)相關(guān)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)小干擾RNA手段干擾lncRNA OIP5-AS1可以抑制人乳腺癌細(xì)胞的遷移、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化及Notch1表達(dá)，這一結(jié)論可能使lncRNA OIP5-AS1成為乳腺癌治療的又一個(gè)新的潛在靶點(diǎn)，這一結(jié)論也可以為乳腺癌治療中面臨的轉(zhuǎn)移難題提供一條新的治療思路