王振杰，張康，梁莉，熊晴晴，杜華華

（浙江大學(xué)飼料科學(xué)研究所，浙江省飼料與動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310058）

鐵不僅是動(dòng)物體內(nèi)重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而且是病原微生物生長(zhǎng)繁殖的必需營(yíng)養(yǎng)素。在生豬養(yǎng)殖過(guò)程中，由于出生時(shí)仔豬體內(nèi)鐵的貯備量少、母豬乳汁中鐵含量低和快速生長(zhǎng)需要鐵量較多等矛盾易引起仔豬的缺鐵癥，所以給初生仔豬補(bǔ)鐵是被普遍認(rèn)可和接受的缺鐵癥預(yù)防或治療手段。然而，在感染情況下，補(bǔ)鐵卻引起了斷奶仔豬的腸道菌群紊亂，加重了仔豬的腹瀉病情，給養(yǎng)豬業(yè)造成了更大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。

鐵穩(wěn)態(tài)平衡是動(dòng)物機(jī)體健康的保證。在哺乳動(dòng)物中，超過(guò)70%的鐵以血紅蛋白的形式儲(chǔ)存在紅細(xì)胞中，其余的鐵則儲(chǔ)存在巨噬細(xì)胞和肝臟中。鐵在體內(nèi)主要以結(jié)合態(tài)存在，其主要儲(chǔ)存形式包括鐵蛋白、含血紅素的蛋白質(zhì)（如細(xì)胞色素）、含鐵硫簇的蛋白質(zhì)（如琥珀酸脫氫酶）和其他含鐵蛋白質(zhì)（如2-氧戊二酸依賴性雙加氧酶）[2]。健康動(dòng)物機(jī)體在鐵調(diào)素（hepcidin）的調(diào)節(jié)下能維持鐵的穩(wěn)態(tài)，但這種穩(wěn)態(tài)可以被細(xì)菌或病毒感染打破。炎癥信號(hào)能誘導(dǎo)鐵調(diào)素的表達(dá)增加，從而使血漿中鐵水平下降，引起機(jī)體低鐵血癥[3]。在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)，細(xì)胞外的游離鐵濃度（1×10－18μmol/L）遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于細(xì)菌生長(zhǎng)所需濃度（1×10－7μmol/L），感染期間游離鐵濃度更低，因此，宿主細(xì)胞和病原菌之間經(jīng)常存在鐵競(jìng)爭(zhēng)[4]。在此過(guò)程中，宿主細(xì)胞會(huì)分泌大量乳鐵蛋白（lactoferrin,Lf）、轉(zhuǎn)鐵蛋白、嗜鐵素等鐵結(jié)合蛋白，結(jié)合體內(nèi)游離鐵以應(yīng)對(duì)細(xì)菌的入侵[5]。

Lf最早于1939年在牛奶中被發(fā)現(xiàn)，其在牛奶中的含量特別豐富，也存在于細(xì)胞外分泌物如淚液、鼻液、唾液、胰液和胃腸道分泌物中[6]。Lf作為一種鐵結(jié)合蛋白，不僅參與鐵的轉(zhuǎn)運(yùn)，而且具有調(diào)節(jié)免疫、抗菌殺菌、抗癌等多種功能，是新生動(dòng)物必需的一種安全可靠的營(yíng)養(yǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)。目前已有研究表明，Lf 是嬰兒腸上皮發(fā)育的必需調(diào)節(jié)劑，在腸上皮細(xì)胞的增殖分化和腸道免疫活性中發(fā)揮著重要作用[7]。因此，Lf 已成為嬰兒配方奶粉中的主要功能性添加成分，也是一種極具開發(fā)潛力的仔豬飼料添加劑。這其中可能的機(jī)制主要包括Lf 能通過(guò)促進(jìn)機(jī)體對(duì)鐵的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)，從而改善腸道中微生態(tài)環(huán)境，加強(qiáng)機(jī)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，提高機(jī)體的抗氧化性能，增強(qiáng)機(jī)體的免疫力[8]。Lf 具有廣譜抗菌能力，一般通過(guò)鐵剝奪、膜滲透、酶抑制等途徑抗菌[9]，還能水解為L(zhǎng)f 肽發(fā)揮抗菌作用[10]。但對(duì)Lf 本身的鐵飽和度是否影響抗菌能力的研究卻鮮見(jiàn)報(bào)道。

根據(jù)Lf中的鐵含量，可以將其分為2種形式，即鐵不飽和乳鐵蛋白（apolactoferrin,Apo-Lf）和鐵飽和乳鐵蛋白（hololactoferrin,Holo-Lf）。本試驗(yàn)旨在通過(guò)研究不同鐵飽和度的豬Lf對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響，重點(diǎn)分析不同鐵飽和度Lf抑菌的機(jī)制和結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，為基于Lf 新型抑菌劑的開發(fā)和在動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 乳鐵蛋白的準(zhǔn)備

豬乳鐵蛋白（天然乳鐵蛋白）購(gòu)于德國(guó)Hoelzel Diagnostika 公司。采用高效液相色譜法檢測(cè)天然Lf 的純度為98.0%，鐵飽和度為22.6%。根據(jù)WANG 等[11]的方法制備Apo-Lf（鐵飽和度為6.9%）和Holo-Lf（鐵飽和度為100.0%）。將3 種不同鐵飽和度的Lf 分別使用無(wú)菌水配制成質(zhì)量濃度為500 μg/mL的母液，保存在4 ℃冰箱中，備用。

1.2 抑菌活性試驗(yàn)

大腸埃希菌K88（Escherichia coliK88）、金黃色葡萄球菌ATCC 25923（Staphylococcus aureusATCC 25923）、鼠傷寒沙門菌CMCC50013（Salmonella typhimuriumCMCC50013），均購(gòu)自中國(guó)微生物菌種保藏中心（北京）。各細(xì)菌在Luria-Bertani（LB）液體培養(yǎng)基中、于37 ℃條件下培養(yǎng)過(guò)夜，以250 r/min離心收集。用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline,PBS）重懸，調(diào)整菌液濃度至1×106CFU/mL。采用分光光度法測(cè)定生物濁度以評(píng)估Lf 對(duì)細(xì)菌培養(yǎng)基中液體生長(zhǎng)的影響[12]。在LB 液體培養(yǎng)基中連續(xù)稀釋Lf，將制備好的Lf 工作液加入含有100 μL 細(xì)菌溶液的96 孔培養(yǎng)板中，使最終的Lf質(zhì)量濃度達(dá)到400.0、200.0、50.0、25.0、12.5 μg/mL。使用酶標(biāo)儀檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)的D（600 nm）值，以反映各菌株在37 ℃條件下的生長(zhǎng)情況。為了證明鐵在Apo-Lf抑菌活動(dòng)中的作用，于24 h時(shí)，在Apo-Lf的LB 液體培養(yǎng)基中添加6.25 μmol/L 次氮基三乙酸鐵，并在48 h時(shí)檢測(cè)D（600 nm）值。

1.3 電子顯微鏡觀察

分別用Apo-Lf溶液（50.0 μg/mL）和Holo-Lf溶液（50.0 μg/mL）培養(yǎng)濃度為1×103CFU/mL 的細(xì)菌24 h。離心得到的細(xì)菌用PBS洗滌，之后用2.5%戊二醛固定，再用梯度濃度（30%～100%）乙醇脫水，隨后轉(zhuǎn)移到乙醇/乙酸異戊酯體積比為1∶1 的混合溶液中脫水30 min，然后轉(zhuǎn)移到乙酸異戊酯溶液中脫水1 h。在HCP-2 型臨界點(diǎn)干燥儀（日本Hitachi公司）中用CO2對(duì)樣品進(jìn)行干燥，給處理好的樣品涂上鈀膜，用SU8010型掃描電子顯微鏡（日本Hitachi公司）觀察細(xì)菌的形態(tài)。

1.4 細(xì)菌生長(zhǎng)試驗(yàn)

為了確定細(xì)菌生長(zhǎng)過(guò)程中對(duì)鐵的需求，用添加或者不添加次氮基三乙酸鐵（含6.25 μmol/L Fe）的低鐵M9培養(yǎng)基（含1.8 μmol/L Fe）培養(yǎng)細(xì)菌。在24 h 時(shí)，通過(guò)測(cè)定D（600 nm）值反映各菌株的生長(zhǎng)情況。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，利用SPSS 20.0軟件中的單因子方差分析和t檢驗(yàn)（t-test）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以P＜0.01表示差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度的天然乳鐵蛋白對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響

由圖1 可知，Lf 對(duì)大腸埃希菌K88 的生長(zhǎng)有顯著抑制作用，并且這種抑制作用具有劑量依賴性。Lf 濃度越高，對(duì)大腸埃希菌的抑制作用越明顯，其中質(zhì)量濃度大于12.5 μg/mL 的Lf 從24 h 開始顯著抑制了大腸埃希菌K88的生長(zhǎng)（P＜0.05），并在48 h時(shí)達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）。

圖1 不同濃度乳鐵蛋白對(duì)大腸埃希菌K88生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effects of different concentrations of Lf on the growth of E.coli K88

2.2 不同鐵飽和度的乳鐵蛋白對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響

如圖2所示，與對(duì)照組（CK）相比，50.0、200.0 μg/mL Apo-Lf 顯著抑制了大腸埃希菌K88（圖2A）和金黃色葡萄球菌（圖2B）的生長(zhǎng)（P＜0.01），但對(duì)鼠傷寒沙門菌（圖2C）沒(méi)有顯著影響（P＞0.05）。而Holo-Lf對(duì)3種細(xì)菌的生長(zhǎng)均沒(méi)有顯著影響（圖2A～C）。為了更好地展示Lf對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制作用，我們繪制了大腸埃希菌K88 和金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)曲線圖（圖2D～E）。結(jié)果表明，50.0、200.0 μg/mLApo-Lf處理對(duì)大腸埃希菌K88的生長(zhǎng)具有極顯著的抑制作用（P＜0.01），在120 h 內(nèi)細(xì)菌基本不生長(zhǎng)（圖2D）。200.0 μg/mLApo-Lf處理也對(duì)金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)有顯著抑制作用（P＜0.05），但在120 h內(nèi)細(xì)菌緩慢生長(zhǎng)（圖2E）。然而，Holo-Lf對(duì)大腸埃希菌K88和金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)同樣沒(méi)有抑制作用，反而有促進(jìn)細(xì)菌生長(zhǎng)的趨勢(shì)（圖2D～E）。這說(shuō)明鐵飽和度對(duì)Lf的抑菌作用至關(guān)重要，而且Apo-Lf抑制大腸埃希菌K88生長(zhǎng)的效果比抑制金黃色葡萄球菌更顯著。

圖2 Apo-Lf和Holo-Lf對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effects of Apo-Lf and Holo-Lf on the growth of bacteria

為了進(jìn)一步確認(rèn)鐵在Apo-Lf抑制大腸埃希菌生長(zhǎng)中的作用，接著開展了補(bǔ)鐵試驗(yàn)。由圖3可知，被Apo-Lf抑制的大腸埃希菌K88在補(bǔ)鐵之后顯著恢復(fù)了生長(zhǎng)（P＜0.01），24 h后其細(xì)菌含量甚至超過(guò)了對(duì)照組。這說(shuō)明Apo-Lf的抑菌活性主要依賴于低鐵。

圖3 補(bǔ)鐵對(duì)Lf處理的大腸埃希菌K88生長(zhǎng)的影響Fig.3 Effects of Fe supplement on the growth of Lftreated E.coli K88

由于Apo-Lf 對(duì)鼠傷寒沙門菌無(wú)顯著影響（圖2C），說(shuō)明低鐵對(duì)鼠傷寒沙門菌的生長(zhǎng)影響有限，因此進(jìn)一步開展了補(bǔ)鐵試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果（圖4）表明：在向低鐵M9培養(yǎng)基中補(bǔ)充6.25 μmol/L Fe之后，大腸埃希菌K88和金黃色葡萄球菌的數(shù)量均顯著增加（P＜0.01）。但是，補(bǔ)鐵對(duì)鼠傷寒沙門菌的生長(zhǎng)無(wú)明顯影響（P＞0.05）。說(shuō)明低鐵M9 培養(yǎng)基中的鐵水平已滿足了鼠傷寒沙門菌的生長(zhǎng)需要，所以鐵補(bǔ)充對(duì)其生長(zhǎng)無(wú)顯著影響，也提示鼠傷寒沙門菌對(duì)鐵的需求量要比大腸埃希菌K88 和金黃色葡萄球菌的更少。

圖4 培養(yǎng)基中的鐵對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響Fig.4 Effects of Fe in the culture medium on the growth of bacteria

2.3 乳鐵蛋白對(duì)細(xì)菌形態(tài)的影響

掃描電鏡結(jié)果（圖5）顯示：用50.0 μg/mL Lf 處理細(xì)菌24 h 后，對(duì)照組細(xì)菌的表面光滑，形態(tài)特征正常。而用50.0 μg/mL Apo-Lf 處理的大腸埃希菌K88和金黃色葡萄球菌表面粗糙，受損嚴(yán)重，有些細(xì)菌表面甚至出現(xiàn)了裂痕和坑洼，但鼠傷寒沙門菌卻沒(méi)有受到明顯影響。同樣，50.0 μg/mL Holo-Lf 處理對(duì)3種細(xì)菌的表面結(jié)構(gòu)沒(méi)有顯著影響。這些結(jié)果與之前的抑菌結(jié)果一致。

圖5 50.0μg/mLApo-Lf和50.0μg/mL Holo-Lf對(duì)細(xì)菌形態(tài)的影響Fig.5 Effects of 50.0μg/mL Apo-Lf and 50.0μg/mL Holo-Lf on the morphologies of bacteria

2.4 乳鐵蛋白的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

由于Apo-Lf 和Holo-Lf 在抑制大腸埃希菌K88和金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)方面表現(xiàn)出了巨大差異，本研究嘗試從二者的結(jié)構(gòu)方面進(jìn)行解析。利用Uniprot（https://www.uniprot.org/align/）查得豬Lf 的氨基酸序列，使用SWISS-MODEL 構(gòu)建其三維構(gòu)型，得到Lf 的三維結(jié)構(gòu)圖。如圖6 所示：Apo-Lf 在未結(jié)合鐵時(shí)呈開放狀態(tài)，該狀態(tài)下Lf的活性部位更容易與細(xì)菌表面直接作用。結(jié)合鐵后，Apo-Lf由開放狀態(tài)變?yōu)殚]合狀態(tài)的Holo-Lf，該閉合狀態(tài)不利于活性部位與細(xì)菌接觸。

圖6 Apo-Lf和Holo-Lf的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.6 Predicted three-dimensional structures of Apo-Lf and Holo-Lf

3 討論與結(jié)論

Lf對(duì)鐵具有很強(qiáng)的親和力，本研究證明了不同鐵飽和度的Lf 對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制作用存在很大差異。Apo-Lf 能夠有效抑制大腸埃希菌K88 和金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)，而Holo-Lf 對(duì)這2 種細(xì)菌并無(wú)此作用。為證明缺鐵可抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，本研究采用在低鐵培養(yǎng)基中補(bǔ)充鐵的試驗(yàn)，結(jié)果表明低鐵培養(yǎng)基的確能夠在一定程度上限制細(xì)菌生長(zhǎng)。而且，在Apo-Lf 抑菌試驗(yàn)中添加鐵能消除Apo-Lf 的抑制作用，說(shuō)明Apo-Lf 具有較強(qiáng)的鐵結(jié)合能力，其抑菌作用在很大程度上基于競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合了細(xì)菌生長(zhǎng)所需要的鐵元素。前人的研究也發(fā)現(xiàn)，天然Lf 和Apo-Lf 能不同程度地抑制19 種細(xì)菌的生長(zhǎng)，而Holo-Lf 卻不能抑制這些細(xì)菌[13]。Apo-Lf 能夠抑制變形鏈球菌6715-13 的生長(zhǎng)，但加入Holo-Lf 后抑菌效果消失[14]。本研究結(jié)果和前人的結(jié)論都表明，只有低鐵飽和度的Lf能夠抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，天然Lf和Apo-Lf 的鐵結(jié)合能力要強(qiáng)于鐵飽和的Holo-Lf。同時(shí)，在胞外游離鐵被限制的情況下，許多細(xì)菌已經(jīng)進(jìn)化出從Holo-Lf中獲取鐵的機(jī)制。例如一些細(xì)菌表面的特異性Lf受體可以與Lf結(jié)合來(lái)獲取Lf中的鐵[15]。這也可能是Apo-Lf能夠抑制這2種細(xì)菌，而Holo-Lf不能發(fā)揮抑菌作用的原因。但也有報(bào)道指出，牛Apo-Lf和Holo-Lf都可以抑制小鼠體內(nèi)的金黃色葡萄球菌，并且不同鐵飽和度的牛Lf的抑菌活性都是相似的[16]。這可能與Lf的種類、細(xì)菌的種類以及添加Lf的方式有關(guān)。

本研究通過(guò)掃描電鏡發(fā)現(xiàn)，用Apo-Lf 處理過(guò)的大腸埃希菌K88 和金黃色葡萄球菌菌體表面均出現(xiàn)了不同程度的破損，而對(duì)照組和Holo-Lf 處理組則均未出現(xiàn)此情況。這說(shuō)明Apo-Lf 能在一定程度上破壞大腸埃希菌K88 和金黃色葡萄球菌的表面結(jié)構(gòu)，該結(jié)果與其有效抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的試驗(yàn)結(jié)果一致。BRANDENBURG 等[17]發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞外鐵過(guò)量的情況下，Lf 可以直接與一些細(xì)菌的表面結(jié)合，發(fā)揮不依賴于鐵的抑菌作用。這種功能可能與Lf 自身的大量正電荷與細(xì)菌成分相互作用有關(guān)，也可能與Lf 利用N 端葉蛋白酶樣活性裂解富含精氨酸區(qū)域的蛋白質(zhì)從而減弱細(xì)菌毒力有關(guān)[18-19]。當(dāng)然，本研究中Apo-Lf 表現(xiàn)出的破壞細(xì)菌膜的作用可能更大程度上依賴于其結(jié)構(gòu)。通過(guò)對(duì)Lf 的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，豬Lf在不同的鐵飽和度情況下的結(jié)構(gòu)有很大差異。與Holo-Lf 相對(duì)閉合的結(jié)構(gòu)相比，Apo-Lf 的結(jié)構(gòu)更開放、更延展。鐵飽和時(shí)Lf 的構(gòu)象變化可能會(huì)干擾Lf 殺菌區(qū)域與細(xì)菌表面的相互作用，減弱其抑菌活性，而Apo-Lf 開放的結(jié)構(gòu)可能更容易展示其殺菌位點(diǎn)，可以更好地與細(xì)菌表面相互作用，這表明Apo-Lf 構(gòu)象可能也是它發(fā)揮抗菌作用的關(guān)鍵。這一結(jié)果與ANDERSEN 等[20]報(bào)道的人Lf晶體結(jié)構(gòu)研究結(jié)果一致。

本研究首次直接證明了豬Apo-Lf 一方面可以通過(guò)結(jié)合鐵的方式抑制大腸埃希菌K88 和金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)，另一方面也可以利用其開放的構(gòu)象、有效破壞細(xì)菌膜的方式來(lái)抑菌，這為開發(fā)基于Lf 的抑菌制劑提供了理論依據(jù)。但本研究也存在一定的局限性，如Apo-Lf 未能抑制鼠傷寒沙門菌的原因還不清楚，不同鐵飽和度的豬Lf在體內(nèi)對(duì)細(xì)菌的抗菌作用仍有待繼續(xù)探究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)低鐵飽和度的Lf能夠結(jié)合鐵，競(jìng)爭(zhēng)性地奪取細(xì)菌所需鐵而發(fā)揮抑菌作用；低鐵飽和度的Lf能夠破壞細(xì)菌菌體的表面膜結(jié)構(gòu)，而鐵飽和的Lf則無(wú)此功能；低鐵飽和度的Lf三維結(jié)構(gòu)更開放，有利于展示其活性位點(diǎn)。