蘇菲，薛銀，徐麗華，李軍星，余斌，袁秀芳*

（1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，杭州 310021；2.浙江省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，杭州 310018）

豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRS virus,PRRSV）引起的一種急性接觸性傳染病，嚴(yán)重影響全世界養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展[1]。PRRSV主要通過呼吸道入侵豬體內(nèi)，并且能在豬肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)迅速增殖，從而破壞巨噬細(xì)胞免疫體系，造成機(jī)體的非特異性免疫功能下降[2]。呼吸道黏膜是防御PRRSV 的第一道屏障，和肌內(nèi)注射、靜脈注射等免疫途徑相比，通過鼻黏膜途徑免疫能夠更有效和更直接地在動(dòng)物體局部建立起免疫反應(yīng)，是抵御PRRSV 入侵較為理想的方法。由于黏膜結(jié)構(gòu)的特殊性，黏膜途徑免疫對(duì)疫苗的穩(wěn)定性和免疫原性要求較高。盡管PRRSV 滅活疫苗比減毒活疫苗更安全，但是其免疫原性較弱，單獨(dú)免疫并不能達(dá)到理想的保護(hù)作用[1,3]，因此需要尋找合適的黏膜佐劑來加以輔助。

大腸埃希菌不耐熱腸毒素B 亞單位（B subunit of heat-labile enterotoxin, LTB）是一種較好的黏膜免疫佐劑，在小鼠、雞和豬等動(dòng)物體內(nèi)對(duì)多種疫苗均具有免疫增強(qiáng)作用[4-6]。研究發(fā)現(xiàn)，LTB所誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)與免疫途徑有關(guān)。REN 等[6]發(fā)現(xiàn)：LTB 通過滴鼻途徑給藥能夠顯著提高小鼠體內(nèi)H5N1病毒樣顆粒特異性的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)，并且能夠在小鼠感染同源或異源毒株后明顯提高其存活率；而LTB 通過肌內(nèi)注射給藥只能提高小鼠體內(nèi)的特異性免疫應(yīng)答水平，不能保護(hù)小鼠免受同源或異源毒株的感染。類似的，LEE 等[7]發(fā)現(xiàn)LTB 經(jīng)滴鼻免疫后能顯著提高福氏耐格里阿米巴原蟲Nfa1 蛋白的特異性免疫球蛋白G（immunoglobulin G,IgG）和免疫球蛋白A（IgA）抗體水平以及脾淋巴細(xì)胞中干擾素-γ（interferon-γ,IFN-γ）和白介素-2（interleukin-2,IL-2）等細(xì)胞因子的表達(dá)水平，并且能夠明顯提高小鼠在感染福氏耐格里阿米巴原蟲后的存活率。另外，LEI 等[8]也發(fā)現(xiàn)LTB 與H5N1 血凝素重組乳酸乳球菌一同滴鼻免疫雞后，能夠顯著增強(qiáng)血清中的特異性IgG和鼻黏液中的特異性IgA抗體水平以及中和抗體水平，并且為感染雞提供100%的保護(hù)力。值得注意的是，有研究發(fā)現(xiàn)，LTB 作為肺炎支原體黏附素P97 抗原佐劑時(shí)，通過肌內(nèi)注射免疫偏向于增強(qiáng)Th2 型免疫應(yīng)答，而通過滴鼻途徑免疫偏向于增強(qiáng)Th1 型免疫應(yīng)答[9]。人參皂苷Rg1 屬于原人參三醇型皂苷，是人參根和莖葉中的主要皂苷單體[10]。研究表明，人參皂苷Rg1 在動(dòng)物體內(nèi)能夠調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫反應(yīng)，具有佐劑功能。YUAN 等[11]發(fā)現(xiàn)通過皮下注射Rg1 能夠明顯提高小鼠體內(nèi)乙肝病毒表面蛋白的特異性IgG 及其亞類IgG1、IgG2b的抗體水平，并提高脾淋巴細(xì)胞中IFN-γ、IL-4mRNA 表達(dá)水平。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，Rg1經(jīng)皮下免疫小鼠后能顯著提高小鼠血清中的卵清蛋白特異性IgG、IgG1和IgG2a抗體水平，并促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞的增殖和分化，增強(qiáng)Th1 和Th2 型細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，并且其作用機(jī)制與Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4, TLR4）信號(hào)通路密切相關(guān)[12-13]。但是有關(guān)Rg1的黏膜免疫佐劑活性尚未見報(bào)道。在前期工作中，我們發(fā)現(xiàn)LTB 和人參皂苷Rg1 聯(lián)合滴鼻免疫能夠明顯提高小鼠血清、陰道灌洗液、支氣管灌洗液和膽汁中的抗原特異性IgA 抗體水平，并顯著增大脾淋巴細(xì)胞中IFN-γ和IL-6mRNA 表達(dá)水平[14]。另外，我們還發(fā)現(xiàn)LTB 和Rg1聯(lián)合免疫能夠改變白細(xì)胞中淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的比例，但是不改變白細(xì)胞總數(shù)。這些研究結(jié)果表明，LTB-Rg1作為鼻黏膜復(fù)合佐劑具有較大的發(fā)展空間。

本研究將重組LTB 和人參皂苷Rg1 作為PRRSV滅活疫苗的鼻黏膜復(fù)合佐劑滴鼻免疫小鼠，探究其對(duì)PRRSV 疫苗誘導(dǎo)的特異性體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答的增強(qiáng)作用，明確LTB-Rg1作為鼻黏膜復(fù)合佐劑的優(yōu)勢并評(píng)估其生物安全性，為進(jìn)一步研制安全有效的黏膜免疫佐劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

人參皂苷Rg1純度為99.98%，購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；重組LTB 由構(gòu)建的pPIC9KLTB 質(zhì)粒在畢赤酵母GS115 上表達(dá)產(chǎn)生，具體方法參見文獻(xiàn)[9]；動(dòng)物組織總RNA磁珠提取試劑盒，購自濟(jì)凡生物科技（北京）有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptTMRT Reagent Kit）和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reation,qRT-PCR）試劑盒（TB GreenTMPremix Ex TaqTM），購自寶生物工程（大連）有限公司；PRRSV抗體檢測試劑盒，購自美國愛德士公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG 和IgA 抗體，購自美國Santa Cruz公司；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測定試劑盒、堿性磷酸酶測定試劑盒、血尿素氮測定試劑盒和葡萄糖測定試劑盒，均購自浙江省寧波普瑞柏生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 病毒

PRRSV JXA-1 毒株在Marc-145 細(xì)胞上培養(yǎng)，檢測到該病毒滴度為1×106TCID50/mL（TCID50為半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量）。病毒用0.05%β-丙內(nèi)酯在4 ℃條件下滅活12 h，并在37 ℃條件下繼續(xù)放置2 h。滅活后的病毒接種到Marc-145 細(xì)胞上，連續(xù)盲傳3代，觀察10 d內(nèi)是否有細(xì)胞病變。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雌性SPF 級(jí)ICR 小鼠（18～20 g）購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，于浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)，飼喂無菌飼料和水。室內(nèi)溫度為（25±10）℃，相對(duì)濕度為（50±10）%。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)得到浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2020001）。

1.4 動(dòng)物分組與處理

將325 只ICR 小鼠隨機(jī)分成5 組，每組65 只。1～5 組小鼠分別滴鼻免疫生理鹽水，PRRSV 滅活抗原（1×105TCID50/只），PRRSV 滅活抗原（1×105TCID50/只）混合LTB（20 μg/只）或Rg1（30 μg/只）或LTB-Rg1（20 μg/只+30 μg/只），每次滴鼻總量為50 μL/只。免疫3 次，分別在實(shí)驗(yàn)0、7、21 d 進(jìn)行，免疫前通過吸入異氟烷麻醉小鼠。于第1 次免疫（一免）后0、7、14、21、28、35 d稱量小鼠體質(zhì)量；于一免后2、7、21、35 d每組處死5只小鼠，采集血液用于生化檢測；于一免后7、14、21、28、35、42、49、56 d每組處死5 只小鼠，采集血液和支氣管肺泡灌洗液用于檢測小鼠IgG、IgM 和IgA 抗體水平；于一免后35 d每組處死5 只小鼠，采集其脾臟和肺臟并分離單個(gè)核細(xì)胞，用于細(xì)胞因子mRNA轉(zhuǎn)錄水平的檢測。每只小鼠用1 mL磷酸緩沖鹽溶液灌洗支氣管肺泡，所有樣品保存于－20 ℃冰箱中，備用。

1.5 生化檢測

血液離心后取上清液，分別按照丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測定試劑盒、堿性磷酸酶測定試劑盒、血尿素氮測定試劑盒和葡萄糖測定試劑盒的說明書操作，利用LW C400全自動(dòng)生化分析儀（廣東省深圳藍(lán)韻醫(yī)療器械公司）檢測。

1.6 特異性IgM、IgG 和IgA 抗體水平的檢測

參考文獻(xiàn)[15]，采用美國愛德士公司生產(chǎn)的PRRSV 抗原包被板，利用間接酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）檢測小鼠血清和支氣管肺泡灌洗液中PRRSV特異性IgM、IgG 和IgA 抗體水平。將100μL 小鼠血清（以體積比1∶100稀釋）或支氣管肺泡灌洗液（以體積比1∶10稀釋）加入包被板中，于37 ℃條件下孵育1 h；洗滌后加入100μL 辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗，其中IgM 和IgG 抗體均按體積比1∶5 000 稀釋，IgA抗體按體積比1∶2 000稀釋，室溫下孵育1 h；洗滌后加入100 μL 3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺，室溫孵育15 min；加終止液終止反應(yīng)，于酶標(biāo)儀中測定450 nm波長下的吸光度值。

1.7 細(xì)胞因子mRNA 轉(zhuǎn)錄水平的檢測

參考文獻(xiàn)[12,16]，采集小鼠脾臟和肺臟組織并分離出單個(gè)核細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106個(gè)/mL，并接種到24孔板中，每孔2 mL，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h；加入終質(zhì)量濃度為10 μg/mL 的PRRSV抗原刺激24 h；收集細(xì)胞裂解液，按照動(dòng)物組織總RNA 磁珠提取試劑盒說明書提取總RNA；反轉(zhuǎn)錄后利用染料法進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，詳細(xì)步驟參照文獻(xiàn)[17]。利用軟件Primer Express 3.0設(shè)計(jì)引物序列（表1），并送至生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以生理鹽水組為校準(zhǔn)樣本，其他組為待測樣本，采用2－ΔΔCT法進(jìn)行相對(duì)定量分析。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，采用GraphPad Prism 5.0 軟件中的鄧肯多重比較法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 LTB-Rg1 對(duì)PRRSV 特異性IgM 抗體水平的增強(qiáng)作用

由圖1 可知，小鼠滴鼻免疫LTB-Rg1/PRRSV后能夠在血清和支氣管肺泡灌洗液中迅速產(chǎn)生較高水平的PRRSV 特異性IgM 抗體。在第1 次免疫（一免）后7 d，LTB-Rg1/PRRSV 組小鼠血清中的特異性IgM 抗體水平明顯高于PRRSV 單獨(dú)疫苗組（P＜0.001）和Rg1/PRRSV 組（P＜0.01）；在一免后14 d，除生理鹽水組外其他各組小鼠的血清IgM 抗體水平達(dá)到峰值，其中LTB-Rg1/PRRSV 組的IgM 抗體水平明顯高于PRRSV單獨(dú)疫苗組（P＜0.001），但與LTB/PRRSV 組和Rg1/PRRSV 組相比無明顯差異；在一免后21、28 d，LTB-Rg1/PRRSV組的IgM抗體水平均明顯高于PRRSV單獨(dú)疫苗組（P＜0.001）、LTB/PRRSV 組和Rg1/PRRSV 組（P＜0.01）。相似的，在一免后7 d，LTB-Rg1/PRRSV 組小鼠支氣管肺泡黏液中的特異性IgM 抗體水平明顯高于PRRSV 單獨(dú)疫苗組、LTB/PRRSV 組和Rg1/PRRSV組（P＜0.01）；在一免后14 d，除生理鹽水組外其他各組小鼠的支氣管肺泡黏液中IgM 抗體水平達(dá)到峰值，其中LTB-Rg1/PRRSV 組的IgM 抗體水平明顯 高 于PRRSV 單 獨(dú) 疫 苗 組（P＜0.001）、LTB/PRRSV 組（P＜0.01）和Rg1/PRRSV 組（P＜0.001），并且這種較高的IgM水平一直維持到一免后35 d。

圖1 小鼠第1次滴鼻免疫后PRRSV特異性IgM抗體水平Fig.1 PRRSV-specific IgM antibody levels after the first intranasal immunization in mice

2.2 LTB-Rg1 對(duì)PRRSV 特 異 性IgG 和IgA 抗 體水平的增強(qiáng)作用

由圖2可見，LTB-Rg1/PRRSV能夠顯著提高小鼠血清中PRRSV特異性IgG抗體水平和支氣管肺泡黏液中PRRSV特異性IgA抗體水平。在血清IgG抗體反應(yīng)中，滴鼻免疫LTB-Rg1/PRRSV的小鼠從一免后14 d 開始產(chǎn)生較高水平的IgG 抗體，并在一免后35 d達(dá)到峰值，其抗體水平顯著高于PRRSV單獨(dú)疫苗組（P＜0.001）、LTB/PRRSV 組（P＜0.01）和Rg1/PRRSV 組（P＜0.001），這種較高的IgG 抗體水平一直維持到一免后56 d。在支氣管肺泡IgA抗體反應(yīng)中，滴鼻免疫LTB-Rg1/PRRSV的小鼠從一免后7 d就開始產(chǎn)生較高水平的IgA 抗體，其抗體水平顯著高于PRRSV 單獨(dú)疫苗組和Rg1/PRRSV 組（P＜0.05），并且在一免后35 d 達(dá)到峰值，此時(shí)抗體水平明顯高于PRRSV 單獨(dú)疫苗組（P＜0.001）、LTB/PRRSV組（P＜0.05）和Rg1/PRRSV組（P＜0.01），這種較高的IgA抗體水平一直維持到一免后56 d。上述結(jié)果表明，LTB-Rg1作為鼻黏膜佐劑對(duì)小鼠全身和局部黏膜中的抗原特異性抗體水平均具有較好的增強(qiáng)作用。

圖2 小鼠第1次滴鼻免疫后PRRSV特異性IgG（A1～A3）和IgA（B1～B3）抗體水平Fig.2 PRRSV-specific IgG(A1-A3)and IgA(B1-B3)antibody levels after the first intranasal immunization in mice

2.3 LTB-Rg1 對(duì)小鼠脾臟中PRRSV 特異性細(xì)胞因子mRNA 轉(zhuǎn)錄水平的影響

由圖3可知，滴鼻免疫LTB-Rg1/PRRSV能夠顯著提高PRRSV誘導(dǎo)的小鼠脾臟中IFN-γ、IL-2、IL-5和IL-10的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。與PRRSV單獨(dú)免疫組和Rg1/PRRSV組相比，LTB-Rg1/PRRSV能夠顯著提高IFN-γ（P＜0.001）、IL-2（P＜0.05）、IL-5（P＜0.001）和IL-10（P＜0.001）的轉(zhuǎn)錄水平，并且LTB-Rg1/PRRSV組的IFN-γ（P＜0.001）、IL-5（P＜0.001）和IL-10（P＜0.001）轉(zhuǎn)錄水平明顯高于LTB/PRRSV組。

圖3 小鼠滴鼻免疫后脾臟中細(xì)胞因子相對(duì)表達(dá)水平Fig.3 Relative expression levels of cytokines in spleen after the intranasal immunization in mice

2.4 LTB-Rg1 對(duì)小鼠肺臟中PRRSV 特異性細(xì)胞因子mRNA 轉(zhuǎn)錄水平的影響

由圖4 可見，滴鼻免疫LTB-Rg1/PRRSV 能夠顯著提高PRRSV 誘導(dǎo)的小鼠肺臟中IFN-γ、IL-2、IL-5和IL-10mRNA 轉(zhuǎn)錄水平。與PRRSV 單獨(dú)免疫組相比，滴鼻免疫LTB-Rg1/PRRSV 能夠明顯提高小鼠肺臟中IFN-γ（P＜0.001）、IL-2（P＜0.05）、IL-5（P＜0.01）和IL-10（P＜0.001）的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平；與Rg1/PRRSV 組相比，滴鼻免疫LTB-Rg1/PRRSV 能夠顯著提高小鼠肺臟中IFN-γ（P＜0.001）、IL-2（P＜0.05）、IL-5（P＜0.05）和IL-10（P＜0.01）的mRNA轉(zhuǎn)錄水平；與LTB/PRRSV組相比，滴鼻免疫LTB-Rg1/PRRSV能夠顯著提高小鼠肺臟中IFN-γ（P＜0.001）和IL-5（P＜0.05）的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平。這表明鼻黏膜佐劑LTB-Rg1 對(duì)小鼠體內(nèi)Th1和Th2型免疫反應(yīng)均有促進(jìn)作用。

圖4 小鼠滴鼻免疫后肺臟中細(xì)胞因子相對(duì)表達(dá)水平Fig.4 Relative expression levels of cytokines in lung after the intranasal immunization in mice

2.5 LTB-Rg1 對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響

由圖5 可見，免疫前小鼠的平均體質(zhì)量為（19.14±1.12）g。除PRRSV 單獨(dú)免疫組外，其他各組小鼠的體質(zhì)量在免疫后35 d 內(nèi)持續(xù)增長。LTBRg1/PRRSV 組小鼠的體質(zhì)量與生理鹽水組相比沒有明顯差異，表明鼻黏膜佐劑LTB-Rg1 對(duì)小鼠體質(zhì)量沒有明顯影響。在一免后7 d，PRRSV 組小鼠的體質(zhì)量明顯低于LTB-Rg1/PRRSV 組（P＜0.05），但是在一免后14 d又恢復(fù)增長趨勢。

圖5 第1次滴鼻免疫后LTB-Rg1對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響Fig.5 Effect of LTB-Rg1 on mice body mass after the first intranasal immunization

2.6 LTB-Rg1 對(duì)小鼠血清生化指標(biāo)的影響

為了解LTB-Rg1 對(duì)小鼠的肝腎功能是否有影響，采集小鼠血液并檢測血清中反映肝腎功能狀態(tài)的生化指標(biāo)。由圖6可知，各組小鼠血清中的堿性磷酸酶活力、血尿素氮含量、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活力和葡萄糖含量均無明顯差異，表明鼻黏膜佐劑LTB-Rg1對(duì)小鼠的肝功能和腎功能均沒有明顯影響。

圖6 第1次滴鼻免疫LTB-Rg1對(duì)小鼠血清生化指標(biāo)的影響Fig.6 Effect of LTB-Rg1 on serum biochemical indicators in mice after the first intranasal immunization

3 討論

疫苗是目前防控PRRSV的主要手段。但是，市面上的PRRSV 疫苗往往不能提供足夠的免疫保護(hù)作用，特別是交叉免疫保護(hù)作用，使得疫苗防控PRRSV 的效果非常有限。在疫苗中添加合適的免疫佐劑是解決該問題的有效方法之一。對(duì)于防御PRRSV感染來說，在呼吸道黏膜快速產(chǎn)生高度特異性的先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)具有重要意義。因此，通過鼻黏膜途徑免疫是有效防控PRRSV 較為理想的方法。盡管LTB 已被廣泛用作黏膜免疫佐劑[8,18-19]，但是其通過滴鼻途徑給藥的效果仍然飽受爭議。在早期動(dòng)物模型研究中，LTB 滴鼻給藥并沒有顯示出任何不良反應(yīng)[19]，但是據(jù)報(bào)道人滴鼻LTB后可能會(huì)出現(xiàn)短期的Bell麻痹癥狀[20]。一項(xiàng)研究表明，在小鼠腦內(nèi)注射低于22.7μg劑量的LTB并不會(huì)對(duì)其腦組織造成任何傷害[21]，但是在前期的研究中，我們發(fā)現(xiàn)LTB低于30μg劑量注射時(shí)并不能充分發(fā)揮其滴鼻佐劑效果[15]。因此，如何在確保安全的前提下發(fā)揮LTB的鼻黏膜佐劑作用是本研究的關(guān)鍵所在。在前期研究中，人參皂苷Rg1 已被證實(shí)具有較好的佐劑效果[12]，但是其黏膜佐劑作用迄今鮮有報(bào)道。研究發(fā)現(xiàn)，佐劑的聯(lián)合使用往往比單獨(dú)使用能夠起到更好的免疫效果，因?yàn)楹线m的成分組合可能會(huì)使疫苗免疫后機(jī)體內(nèi)Th1和Th2水平調(diào)節(jié)至最適于機(jī)體免疫應(yīng)答的狀態(tài)[22]。在本研究中，將安全劑量的LTB（20μg）和人參皂苷Rg1 聯(lián)合起來作為鼻黏膜復(fù)合佐劑，既能保證LTB的劑量使用安全性，又能協(xié)同發(fā)揮2 種佐劑的免疫增強(qiáng)作用，具有重要的研究價(jià)值。

IgA 抗體水平是評(píng)價(jià)黏膜免疫反應(yīng)的一個(gè)重要指標(biāo)[23]；IgM 抗體是機(jī)體接觸抗原后首先產(chǎn)生的抗體，局部黏膜中產(chǎn)生的IgM抗體也被認(rèn)為參與了黏膜免疫應(yīng)答[24]，可作為反映黏膜免疫應(yīng)答水平的指標(biāo)。在本研究中，LTB-Rg1 能夠迅速誘導(dǎo)小鼠呼吸道黏膜和全身產(chǎn)生高水平的特異性IgM抗體，能夠顯著提高小鼠呼吸道黏膜中特異性IgA 和血清中的特異性IgG 抗體水平，并且能夠有效延長這些抗體在局部黏膜和全身的作用時(shí)間，與LTB 和Rg1 單獨(dú)佐劑組相比具有優(yōu)勢。傳統(tǒng)的鋁膠佐劑主要偏向于增強(qiáng)Th2 型免疫反應(yīng)，而對(duì)Th1 型免疫應(yīng)答沒有明顯作用，這并不適合PRRSV 疫苗。研究表明，豬感染PRRSV 后通常缺乏Th1 型免疫應(yīng)答，這可能會(huì)導(dǎo)致免疫抑制反應(yīng)時(shí)間延長，隨后出現(xiàn)抗體反應(yīng)變?nèi)酰《狙Y加重以致病情惡化[25-26]。因此，Th1 型免疫應(yīng)答在抵御PRRSV 感染過程中至關(guān)重要。在本研究中，LTB-Rg1 能夠上調(diào)脾臟和肺臟中Th1 型（IFN-γ和IL-2）和Th2 型（IL-5和IL-10）細(xì)胞因子的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平，誘導(dǎo)Th1/Th2 平衡型免疫增強(qiáng)反應(yīng)，對(duì)于防御PRRSV 感染具有重要意義。另外，在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)滴鼻免疫LTB-Rg1 僅能夠增強(qiáng)呼吸道黏膜中PRRSV 中和抗體水平，而對(duì)血清中的中和抗體水平無明顯影響[15]。值得注意的是，雖然中和抗體水平往往被認(rèn)為是評(píng)價(jià)免疫保護(hù)作用的一個(gè)重要指標(biāo)[27-28]，但是有研究發(fā)現(xiàn)豬在缺乏中和抗體的情況下也可以抵御PRRSV感染[29-30]。因此，免疫系統(tǒng)中可能還存在其他因素可以有效控制感染，比如非中和抗體、T細(xì)胞反應(yīng)等。

在本研究中，免疫小鼠未被觀察到與復(fù)合佐劑相關(guān)的臨床癥狀。在一免后7 d，單獨(dú)疫苗組的小鼠體質(zhì)量明顯下降，但是之后又恢復(fù)正常的增長趨勢，推測可能是免疫應(yīng)激造成的；而添加LTB-Rg1佐劑的小鼠在免疫后體質(zhì)量持續(xù)穩(wěn)定增長，說明該佐劑可能有一定的抗應(yīng)激作用。另外，LTB-Rg1對(duì)小鼠的肝腎功能沒有明顯影響。因此，LTB-Rg1是一種比較安全且極具潛力的鼻黏膜免疫佐劑，其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本研究為研發(fā)新型PRRSV 滅活疫苗佐劑提供了依據(jù)，也為防控PRRSV提供了新思路。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，滴鼻免疫LTB-Rg1能夠促進(jìn)小鼠血清和呼吸道黏膜表面快速產(chǎn)生較高水平的PRRSV特異性IgM、IgG和IgA抗體，并且能夠有效延長這些抗體的作用時(shí)間，顯著上調(diào)PRRSV誘導(dǎo)的小鼠脾臟和肺臟細(xì)胞中Th1和Th2型細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄水平，增強(qiáng)特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答。而且該復(fù)合佐劑對(duì)小鼠的體質(zhì)量增長和肝腎功能均無明顯影響，是一種比較安全且極具潛力的鼻黏膜免疫佐劑。本研究結(jié)果證實(shí)了該復(fù)合佐劑的優(yōu)勢，為其進(jìn)一步在豬上開展研究奠定了基礎(chǔ)。