李澤琦，汪玉倩，李小艷，林向民，袁軍

（福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建省農(nóng)業(yè)生態(tài)過(guò)程與安全監(jiān)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350002）

外膜蛋白（outer membrane protein, OMP）是革蘭氏陰性菌特有的一種膜結(jié)構(gòu)成分，主要鑲嵌在外膜及周質(zhì)空間上，在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸、宿主侵染及抗逆性等方面發(fā)揮著重要作用[1-2]。例如：在不同酸堿度、溫度、壓力、滲透壓等外界環(huán)境脅迫條件下，OmpA和OmpX等外膜蛋白能進(jìn)行特異表達(dá)以阻止一些特定物質(zhì)進(jìn)入，從而維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)[3]；當(dāng)大腸埃希菌暴露于酸性或高離子濃度環(huán)境下，OmpX 的表達(dá)量會(huì)在幾分鐘內(nèi)顯著增加，以調(diào)節(jié)細(xì)菌外膜的滲透性和適應(yīng)性[4]；而細(xì)菌雙調(diào)節(jié)系統(tǒng)組分OmpR的磷酸化可直接調(diào)節(jié)大腸埃希菌中主要孔蛋白OmpF 和OmpC 的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，后者以三聚體的形式形成親水通道，使得細(xì)胞內(nèi)外滲透壓達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡[5]。

嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）是一種革蘭氏陰性短桿菌，具有很強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性，在淡水和土壤等環(huán)境中廣泛存在，并且是一種可以直接感染或與其他病原細(xì)菌共同感染的病原菌，在人和其他哺乳動(dòng)物中可引起敗血癥或腹瀉，還會(huì)對(duì)魚(yú)類(lèi)和貝類(lèi)等淡水養(yǎng)殖動(dòng)物造成影響[6]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在嗜水氣單胞菌ATCC 7966 中至少存在58 個(gè)外膜蛋白（https://www.uniprot.org）[7]，而當(dāng)前研究多集中在OmpA、OmpF 和OmpC 等少數(shù)高豐度外膜蛋白上，缺乏對(duì)其他外膜蛋白功能的系統(tǒng)研究。本課題組在前期研究中已經(jīng)對(duì)嗜水氣單胞菌（A. hydrophila）ATCC 7966 外膜蛋白的部分生理功能及耐藥特性等進(jìn)行了較為系統(tǒng)的分析，發(fā)現(xiàn)某些外膜蛋白的缺失會(huì)影響該病原菌的耐藥性及毒力，但這些外膜蛋白在環(huán)境脅迫下所發(fā)揮的作用尚且未知[7]。本研究在此基礎(chǔ)上對(duì)33 株外膜蛋白缺失菌株在不同環(huán)境脅迫條件下的抗逆性進(jìn)行了系統(tǒng)評(píng)估，以期為嗜水氣單胞菌外膜蛋白的生物學(xué)功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒及菌株

本實(shí)驗(yàn)所使用的菌株為嗜水氣單胞菌ATCC 7966、大腸埃希菌MC1061 及S17-λpir。本研究所涉及的33 株外膜蛋白基因敲除菌株均保存于福建省農(nóng)業(yè)生態(tài)過(guò)程與安全監(jiān)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室且經(jīng)過(guò)測(cè)序驗(yàn)證。所有菌株均在LB（Luria-Bertani）液體培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)，并轉(zhuǎn)接培養(yǎng)至D（600 nm）=1.0 后備用。

1.2 基因敲除技術(shù)

本實(shí)驗(yàn)以自殺性質(zhì)粒pRE112為載體，并以2次同源重組的方法構(gòu)建遺傳缺失突變體[7]。具體方法如下：分別設(shè)計(jì)約500 bp的左臂（P12）和右臂（P34），利用聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction,PCR）檢驗(yàn)設(shè)計(jì)的目的片段，并與酶切好的pRE112質(zhì)粒進(jìn)行連接，之后轉(zhuǎn)入大腸埃希菌MC1061 以提高轉(zhuǎn)化效率，再轉(zhuǎn)入大腸埃希菌S17-λpir并挑取陽(yáng)性單克隆，通過(guò)PCR 驗(yàn)證正確后將攜帶重組質(zhì)粒的S17-λpir與受體菌（嗜水氣單胞菌）培養(yǎng)至D（600 nm）=1.0，然后將供體菌與受體菌按4∶1的體積比例（供體菌800 μL，受體菌200 μL）加入無(wú)菌的1.5 mL 離心管并混勻，以5 000 r/min 離心5 min，在無(wú)菌環(huán)境中棄去上清液，再加入50 μL 新鮮LB 液體培養(yǎng)基，吸打混勻沉淀后滴于含LB固體培養(yǎng)基的濾紙片平板上，待自然晾干后放入30 ℃培養(yǎng)箱并靜置培養(yǎng)14～16 h以進(jìn)行細(xì)菌接合。將平板取出，加入500 μL新鮮LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行清洗，離心，棄上清液；再加入500 μL LB 液體培養(yǎng)基，取100 μL 菌液涂于含有100 μg/mL 氨芐西林和30 μg/mL 氯霉素抗性的LB平板上，置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。次日進(jìn)行PCR驗(yàn)證，將驗(yàn)證正確的單克隆涂布于含20%蔗糖的LB固體培養(yǎng)基平板上，對(duì)需敲除的基因設(shè)計(jì)P5/P6引物，過(guò)夜培養(yǎng)后挑取單克隆進(jìn)行驗(yàn)證，如果P5/P6無(wú)條帶而對(duì)照有相應(yīng)目的基因條帶則結(jié)果正確。將驗(yàn)證正確的細(xì)菌劃線純化并保存。

1.3 嗜水氣單胞菌外膜蛋白抗逆性測(cè)定

1.3.1 滲透壓脅迫

本實(shí)驗(yàn)設(shè)置4個(gè)鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度，分別為0.5%、1%、3%、4%NaCl。具體方法如下：將過(guò)夜菌株轉(zhuǎn)接培養(yǎng)至D（600 nm）=1.0 左右，取2 μL 菌液接種在配制好的含有不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)NaCl的LB固體培養(yǎng)基平板上，對(duì)照組為普通LB固體培養(yǎng)基（含1%NaCl），然后置于30 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)16 h，觀察并記錄結(jié)果。上述實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)2次。

1.3.2 金屬離子脅迫

分別配制含有鐵（Fe3+）、鋅（Zn2+）、鉻（Cr6+）和鈷（Co2+）4 種金屬離子的M9 固體營(yíng)養(yǎng)限制性培養(yǎng)基（0.4%葡萄糖，5×M9，1.5%瓊脂粉，2% 1 mol/L MgSO4，1% 0.1 mol/L CaCl2，1%微量元素，1%生長(zhǎng)因子），其終質(zhì)量濃度分別為400、800、0.025、0.000 16μg/mL。將D（600 nm）=1.0的菌液以1∶100體積比添加到1 mL LB液體培養(yǎng)基中，取2 μL滴加在含有不同金屬離子的M9培養(yǎng)基上，于30 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)16 h后拍照，保存。上述實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)2次。

1.3.3 pH 脅迫

配制pH梯度分別為6.0、7.5和8.5的LB液體培養(yǎng)基。酸性培養(yǎng)基配制方法為在50 mL LB 液體培養(yǎng)基中加入1.07 g 2-（N-嗎啉代）乙磺酸（MES），混勻后用HCl 將pH 調(diào)至6.0。堿性培養(yǎng)基配制方法為在50 mL LB 液體培養(yǎng)基中分別加入1 g 3-（N-嗎啡啉）丙磺酸（MOPS）和1.1 g 3-[（1，1-二甲基-2-羥乙基）氨基]-2-羥基-1-丙磺酸（AMPSO），并用KCl 將pH 分別調(diào)至7.5 和8.5。上述培養(yǎng)基均經(jīng)高壓滅菌后保存，備用。將菌液按1∶100 體積比添加到各pH 梯度培養(yǎng)基中，然后將混合菌液按每孔300 μL 加入96 孔板進(jìn)行培養(yǎng)，最后利用全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀（芬蘭Bioscreen 公司）進(jìn)行測(cè)定。每個(gè)pH 重復(fù)3 次，每小時(shí)測(cè)定一次并記錄數(shù)據(jù)，連續(xù)培養(yǎng)16 h。

1.3.4 H2O2脅迫

將菌液以1∶100體積比添加到1 mL LB液體培養(yǎng)基中，加入終濃度為2.5 mmol/L 的H2O2，振蕩混勻并在室溫條件下靜置10 min，吸取2 μL 滴在LB固體培養(yǎng)基平板上，在30 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)16 h，觀察結(jié)果并拍照，保存。

1.4 數(shù)據(jù)分析

通過(guò)STRING 在線網(wǎng)站（https://string-db.org/）構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用預(yù)測(cè)網(wǎng)絡(luò)，并結(jié)合實(shí)驗(yàn)中的表型結(jié)果，利用Cytoscape 3.6.1 軟件實(shí)現(xiàn)可視化[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 敲除菌株的驗(yàn)證

本研究利用同源重組敲除技術(shù)對(duì)33株菌的外膜蛋白基因進(jìn)行敲除，并利用P5/P6引物對(duì)目的條帶進(jìn)行擴(kuò)增，部分結(jié)果如圖1所示。野生型菌株在相應(yīng)位置有一條明亮的條帶；而ΔAHA_2991、ΔAHA_0569、ΔAHA_3509和ΔAHA_0521等菌株在對(duì)應(yīng)位置無(wú)條帶，說(shuō)明它們的外膜蛋白基因均被成功敲除（其余基因的敲除結(jié)果已發(fā)表[7]）。

圖1 野生型菌株與部分外膜蛋白基因敲除菌株的PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of wild type (WT) strain and partial OMP gene knockout strains

2.2 滲透壓脅迫檢測(cè)結(jié)果

為了解嗜水氣單胞菌外膜蛋白在不同滲透壓脅迫下的功能，對(duì)構(gòu)建的33個(gè)外膜蛋白基因敲除菌株進(jìn)行了鹽脅迫研究。以1%NaCl 作為對(duì)照，分別測(cè)定了野生型菌株與敲除菌株在0.5%、3%、4%NaCl條件下的生長(zhǎng)情況。如圖2所示，在4%NaCl條件下，ΔlptD（19）、ΔAHA_0904（23）、ΔAHA_0461（25）和ΔAHA_4275（28）菌株與野生型菌株相比具有更高的鹽脅迫耐受性，而在其他NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)條件下無(wú)明顯區(qū)別。

圖2 野生型菌株與外膜蛋白基因敲除菌株在不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)NaCl條件下的測(cè)定結(jié)果Fig.2 Determination results of WT strain and OMP gene knockout strains under different concentrations of NaCl

2.3 pH 脅迫檢測(cè)結(jié)果

為研究嗜水氣單胞菌外膜蛋白在應(yīng)對(duì)pH 脅迫時(shí)的表型變化，分別檢測(cè)了野生型和33株外膜蛋白基因敲除菌株在pH 為6.0、7.5 和8.5 條件下的生長(zhǎng)趨勢(shì)。如圖3 所示，在3 種pH 條件下，ΔAHA_0461菌株的生長(zhǎng)均好于野生型菌株，而ΔAHA_4275菌株則均略弱于野生型菌株；其余菌株生長(zhǎng)狀態(tài)與野生型相比無(wú)明顯差異。

圖3 野生型菌株與外膜蛋白基因敲除菌株在不同pH條件下的生長(zhǎng)情況Fig.3 Growth status of WT strain and OMP gene knockout strains under different pH conditions

2.4 H2O2脅迫檢測(cè)結(jié)果

如圖4 所示：在2.5 mmol/L H2O2脅迫條件下，ΔAHA_1279（7）、ΔAHA_1281（8）、ΔAHA_2145（10）、ΔpilQ（16）、ΔbamA（17）、ΔAHA_0461（25）和ΔAHA_0569（32）菌株的生長(zhǎng)狀態(tài)與野生型菌株相比都有不同程度的削弱，其中以ΔpilQ（16）和ΔbamA（17）菌株最為明顯；其余菌株的生長(zhǎng)狀態(tài)與野生型相似。

圖4 野生型菌株與外膜蛋白基因敲除菌株在不同H2O2濃度下的生長(zhǎng)情況Fig.4 Growth status of WT strain and OMP gene knockout strains under different concentrations of H2O2

2.5 金屬離子脅迫檢測(cè)結(jié)果

為研究嗜水氣單胞菌外膜蛋白在應(yīng)對(duì)不同金屬離子脅迫下的作用，本實(shí)驗(yàn)比較了在Fe3+（FeCl3）、Zn2+（ZnCl2）、Cr6+（K2Cr2O7）和Co2+（CoCl2）4 種金屬離子脅迫條件下野生型與敲除菌株的生長(zhǎng)情況。如圖5 所示：在ZnCl2處理?xiàng)l件下，ΔAHA_2766（5）、ΔAHA_1279（7）、ΔAHA_2282（11）和ΔompW（14）菌株的生長(zhǎng)較野生型菌株受到明顯抑制；在K2Cr2O7和CoCl2處理?xiàng)l件下，ΔAHA_2145（10）和ΔAHA_2282（11）菌株的生長(zhǎng)較野生型菌株受到抑制；而在FeCl3處理?xiàng)l件下，33個(gè)外膜蛋白基因缺失菌株與野生型菌株相比沒(méi)有明顯差異。

圖5 野生型菌株與外膜蛋白基因敲除菌株在不同金屬離子脅迫下的生長(zhǎng)情況Fig.5 Growth status of WT strain and OMP gene knockout strains under different metal ion stresses

2.6 蛋白質(zhì)相互作用預(yù)測(cè)結(jié)果分析

綜合以上研究結(jié)果與STRING 軟件預(yù)測(cè)，對(duì)外膜蛋白缺失菌株受pH、H2O2、金屬離子及滲透壓脅迫表型進(jìn)行匯總，并對(duì)33個(gè)外膜蛋白互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果（圖6）表明，除AHA_0389、AHA_2202和AHA_2699 外，其余外膜蛋白都參與了蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)，說(shuō)明嗜水氣單胞菌的外膜蛋白具有復(fù)雜的蛋白質(zhì)互作調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

圖6 33個(gè)外膜蛋白互作網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)結(jié)果及其響應(yīng)環(huán)境脅迫表型匯總Fig.6 Prediction results of interaction networks of 33 OMPs and summary of the phenotypes responding to environmental stresses

3 討論

外膜蛋白在革蘭氏陰性細(xì)菌的生命活動(dòng)中起著至關(guān)重要的作用。目前，研究者已通過(guò)遺傳、生化和結(jié)構(gòu)分析等方法對(duì)許多典型的外膜蛋白進(jìn)行了詳細(xì)的研究[8]，但是關(guān)于外膜蛋白在魚(yú)類(lèi)病原菌嗜水氣單胞菌中的生物學(xué)特性的報(bào)道很少。本研究對(duì)嗜水氣單胞菌中33 個(gè)外膜蛋白基因敲除菌株在不同環(huán)境脅迫下的表型進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究。結(jié)果顯示，一些外膜蛋白基因敲除菌株在不同環(huán)境條件下表型發(fā)生了變化，提示這些外膜蛋白在相應(yīng)環(huán)境脅迫中具有重要的生物學(xué)功能。

溫度和pH 等物理化學(xué)條件可以對(duì)膜蛋白的功能及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的擴(kuò)散等產(chǎn)生影響，從而破壞膜的完整性。在pH 為6.0、7.5 和8.5 脅迫條件下，ΔAHA_0461菌株的生長(zhǎng)強(qiáng)于野生型，而ΔAHA_4275菌株弱于野生型。AHA_0461和AHA_4275都屬于TonB依賴性受體家族蛋白（TonB-dependent receptors,TBDRs），該家族蛋白可以結(jié)合并轉(zhuǎn)運(yùn)少量但重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并會(huì)影響抗性因子及毒力因子的產(chǎn)生及運(yùn)輸[9]，這可能是ΔAHA_0461和ΔAHA_4275菌株表型的生長(zhǎng)區(qū)別于野生型菌株的原因之一。

ΔlptD、ΔAHA_0904、ΔAHA_0461和ΔAHA_4275菌株在4% NaCl 脅迫條件下較野生型菌株生長(zhǎng)更好。AHA_0904編碼了未知功能的蛋白質(zhì)，其具體功能尚需進(jìn)一步研究。LptD是一種β-桶狀外膜蛋白，在大腸埃希菌中LptD和LptE的突變會(huì)導(dǎo)致其外膜的通透性增加[10]；本研究結(jié)果與其在大腸埃希菌中的報(bào)道并不完全一致，說(shuō)明該基因在適應(yīng)環(huán)境脅迫等方面還起到了其他的作用。AHA_0461和AHA_4275所屬的TonB家族蛋白可以對(duì)抗性因子及毒力分子的轉(zhuǎn)運(yùn)產(chǎn)生影響[9]，它們對(duì)pH 脅迫、鹽脅迫和H2O2脅迫都能夠產(chǎn)生響應(yīng)，說(shuō)明TonB系統(tǒng)可能在維持嗜水氣單胞菌細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中起重要的作用。

氧化應(yīng)激作為一種對(duì)環(huán)境脅迫的響應(yīng)會(huì)對(duì)細(xì)菌細(xì)胞造成影響，使其生長(zhǎng)速率降低，在極端環(huán)境下還會(huì)造成細(xì)胞死亡。而外膜蛋白為革蘭氏陰性細(xì)菌抵御外界環(huán)境變化的第一道防線，可能在響應(yīng)氧化應(yīng)激環(huán)境等方面發(fā)揮作用。在H2O2處理?xiàng)l件下，ΔAHA_1279、ΔAHA_1281、ΔAHA_2145、ΔpilQ、ΔbamA、ΔAHA_0461和ΔAHA_0569菌株的生長(zhǎng)與野生型菌株相比都有不同程度的減弱。研究表明，長(zhǎng)鏈脂肪酸在細(xì)菌感染過(guò)程中起到適應(yīng)外界環(huán)境的作用，并能夠幫助細(xì)胞對(duì)應(yīng)激條件產(chǎn)生一定的耐受性[11]。AHA_2145編碼長(zhǎng)鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，該蛋白的缺失可能導(dǎo)致嗜水氣單胞菌在H2O2脅迫和金屬離子脅迫條件下生長(zhǎng)緩慢。AHA_1279和AHA_1281同屬于OmpA 家族蛋白基因，該家族蛋白具有維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的功能[12]，H2O2則可能通過(guò)影響細(xì)胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性而影響細(xì)菌的生長(zhǎng)狀態(tài)。pilQ和AHA_0569分別編碼分泌素家族蛋白。蛋白質(zhì)分泌系統(tǒng)為細(xì)菌生長(zhǎng)所必需，敲除編碼分泌素家族蛋白基因不利于運(yùn)輸通道對(duì)脅迫因子進(jìn)出的控制，從而使細(xì)菌生長(zhǎng)受到影響。BamA（AHA_1181）可參與細(xì)菌膜蛋白的插入及分泌[13]，H2O2能夠攻擊細(xì)菌的細(xì)胞膜，從而對(duì)膜上的β-桶狀結(jié)構(gòu)造成破壞[14]。因此，BamA的缺失不利于嗜水氣單胞菌抵御外界環(huán)境脅迫，從而造成該菌生長(zhǎng)狀態(tài)的異常。

地球環(huán)境的多樣性導(dǎo)致局部區(qū)域的金屬元素含量不平衡，也迫使周?chē)⑸锏纳L(zhǎng)代謝發(fā)生適應(yīng)性改變。在大多數(shù)細(xì)菌中，銅、鎘或鎂等金屬可通過(guò)細(xì)胞膜上的特異性通道進(jìn)行運(yùn)輸，并存在代謝胞內(nèi)多余金屬離子的機(jī)制[15]。在ZnCl2、K2Cr2O7和CoCl2脅迫條件下，ΔAHA_2766、ΔAHA_1279、ΔAHA_2282、ΔompW（ΔAHA_3953）和ΔAHA_2145菌株的生長(zhǎng)均弱于野生型菌株。AHA_2282和AHA_0904編碼未知功能的蛋白質(zhì)，它們分別響應(yīng)金屬離子和滲透壓的脅迫，因而可能參與了嗜水氣單胞菌對(duì)環(huán)境脅迫的適應(yīng)過(guò)程。AHA_1279（ompAⅡ）作為ompA的等位基因，可能也具有維持細(xì)胞外膜穩(wěn)態(tài)和離子通道活性的作用[16]，這或許是ΔAHA_1279菌株在Zn2+處理?xiàng)l件下生長(zhǎng)較弱的原因。AHA_2766與創(chuàng)傷弧菌MtrB/PioB家族中血紅素相關(guān)外膜蛋白具有氨基酸序列同源性。MtrB/PioB家族蛋白具有Fe（Ⅲ）和Mn（Ⅳ）還原以及細(xì)胞外電子轉(zhuǎn)移等功能[17]。本研究結(jié)果提示，MtrB 的同源蛋白AHA_2766可能也具有電子轉(zhuǎn)移的功能。AHA_3953編碼OmpW家族蛋白。研究表明，革蘭氏陰性菌中的小孔蛋白OmpW參與了鐵轉(zhuǎn)運(yùn)、膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定以及應(yīng)激適應(yīng)等生理過(guò)程[18]。但在本實(shí)驗(yàn)中，OmpW 突變株對(duì)高濃度鐵脅迫環(huán)境并不敏感，因而推測(cè)OmpW家族蛋白在嗜水氣單胞菌中可能具有獨(dú)特的功能。此外，ΔAHA_3953菌株在Zn2+脅迫條件下的生長(zhǎng)較弱，表明OmpW 作為小孔蛋白可能也參與了Zn2+的運(yùn)輸。

綜上所述，外膜蛋白作為保護(hù)細(xì)菌內(nèi)穩(wěn)態(tài)的屏障，在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸、離子運(yùn)輸、毒力因子的分泌、環(huán)境抗逆性以及抗生素耐藥性等方面都具有重要的作用。本研究通過(guò)對(duì)33 個(gè)嗜水氣單胞菌外膜蛋白缺失菌株生理表型的系統(tǒng)分析，發(fā)現(xiàn)多個(gè)外膜蛋白在響應(yīng)不同的環(huán)境脅迫條件中具有重要的作用。本研究結(jié)果有助于深入了解外膜蛋白的生理功能，并為今后全面地了解細(xì)菌外膜蛋白的生物學(xué)功能奠定了科學(xué)基礎(chǔ)。