李澤琦，汪玉倩，李小艷，林向民，袁軍

（福建農(nóng)林大學生命科學學院，福建省農(nóng)業(yè)生態(tài)過程與安全監(jiān)控重點實驗室，福州 350002）

外膜蛋白（outer membrane protein, OMP）是革蘭氏陰性菌特有的一種膜結(jié)構(gòu)成分，主要鑲嵌在外膜及周質(zhì)空間上，在營養(yǎng)物質(zhì)運輸、宿主侵染及抗逆性等方面發(fā)揮著重要作用[1-2]。例如：在不同酸堿度、溫度、壓力、滲透壓等外界環(huán)境脅迫條件下，OmpA和OmpX等外膜蛋白能進行特異表達以阻止一些特定物質(zhì)進入，從而維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)[3]；當大腸埃希菌暴露于酸性或高離子濃度環(huán)境下，OmpX 的表達量會在幾分鐘內(nèi)顯著增加，以調(diào)節(jié)細菌外膜的滲透性和適應(yīng)性[4]；而細菌雙調(diào)節(jié)系統(tǒng)組分OmpR的磷酸化可直接調(diào)節(jié)大腸埃希菌中主要孔蛋白OmpF 和OmpC 的轉(zhuǎn)錄與表達，后者以三聚體的形式形成親水通道，使得細胞內(nèi)外滲透壓達到動態(tài)平衡[5]。

嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）是一種革蘭氏陰性短桿菌，具有很強的環(huán)境適應(yīng)性，在淡水和土壤等環(huán)境中廣泛存在，并且是一種可以直接感染或與其他病原細菌共同感染的病原菌，在人和其他哺乳動物中可引起敗血癥或腹瀉，還會對魚類和貝類等淡水養(yǎng)殖動物造成影響[6]。據(jù)統(tǒng)計，在嗜水氣單胞菌ATCC 7966 中至少存在58 個外膜蛋白（https://www.uniprot.org）[7]，而當前研究多集中在OmpA、OmpF 和OmpC 等少數(shù)高豐度外膜蛋白上，缺乏對其他外膜蛋白功能的系統(tǒng)研究。本課題組在前期研究中已經(jīng)對嗜水氣單胞菌（A. hydrophila）ATCC 7966 外膜蛋白的部分生理功能及耐藥特性等進行了較為系統(tǒng)的分析，發(fā)現(xiàn)某些外膜蛋白的缺失會影響該病原菌的耐藥性及毒力，但這些外膜蛋白在環(huán)境脅迫下所發(fā)揮的作用尚且未知[7]。本研究在此基礎(chǔ)上對33 株外膜蛋白缺失菌株在不同環(huán)境脅迫條件下的抗逆性進行了系統(tǒng)評估，以期為嗜水氣單胞菌外膜蛋白的生物學功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒及菌株

本實驗所使用的菌株為嗜水氣單胞菌ATCC 7966、大腸埃希菌MC1061 及S17-λpir。本研究所涉及的33 株外膜蛋白基因敲除菌株均保存于福建省農(nóng)業(yè)生態(tài)過程與安全監(jiān)控重點實驗室且經(jīng)過測序驗證。所有菌株均在LB（Luria-Bertani）液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，并轉(zhuǎn)接培養(yǎng)至D（600 nm）=1.0 后備用。

1.2 基因敲除技術(shù)

本實驗以自殺性質(zhì)粒pRE112為載體，并以2次同源重組的方法構(gòu)建遺傳缺失突變體[7]。具體方法如下：分別設(shè)計約500 bp的左臂（P12）和右臂（P34），利用聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction,PCR）檢驗設(shè)計的目的片段，并與酶切好的pRE112質(zhì)粒進行連接，之后轉(zhuǎn)入大腸埃希菌MC1061 以提高轉(zhuǎn)化效率，再轉(zhuǎn)入大腸埃希菌S17-λpir并挑取陽性單克隆，通過PCR 驗證正確后將攜帶重組質(zhì)粒的S17-λpir與受體菌（嗜水氣單胞菌）培養(yǎng)至D（600 nm）=1.0，然后將供體菌與受體菌按4∶1的體積比例（供體菌800 μL，受體菌200 μL）加入無菌的1.5 mL 離心管并混勻，以5 000 r/min 離心5 min，在無菌環(huán)境中棄去上清液，再加入50 μL 新鮮LB 液體培養(yǎng)基，吸打混勻沉淀后滴于含LB固體培養(yǎng)基的濾紙片平板上，待自然晾干后放入30 ℃培養(yǎng)箱并靜置培養(yǎng)14～16 h以進行細菌接合。將平板取出，加入500 μL新鮮LB液體培養(yǎng)基進行清洗，離心，棄上清液；再加入500 μL LB 液體培養(yǎng)基，取100 μL 菌液涂于含有100 μg/mL 氨芐西林和30 μg/mL 氯霉素抗性的LB平板上，置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。次日進行PCR驗證，將驗證正確的單克隆涂布于含20%蔗糖的LB固體培養(yǎng)基平板上，對需敲除的基因設(shè)計P5/P6引物，過夜培養(yǎng)后挑取單克隆進行驗證，如果P5/P6無條帶而對照有相應(yīng)目的基因條帶則結(jié)果正確。將驗證正確的細菌劃線純化并保存。

1.3 嗜水氣單胞菌外膜蛋白抗逆性測定

1.3.1 滲透壓脅迫

本實驗設(shè)置4個鹽質(zhì)量分數(shù)梯度，分別為0.5%、1%、3%、4%NaCl。具體方法如下：將過夜菌株轉(zhuǎn)接培養(yǎng)至D（600 nm）=1.0 左右，取2 μL 菌液接種在配制好的含有不同質(zhì)量分數(shù)NaCl的LB固體培養(yǎng)基平板上，對照組為普通LB固體培養(yǎng)基（含1%NaCl），然后置于30 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)16 h，觀察并記錄結(jié)果。上述實驗至少重復2次。

1.3.2 金屬離子脅迫

分別配制含有鐵（Fe3+）、鋅（Zn2+）、鉻（Cr6+）和鈷（Co2+）4 種金屬離子的M9 固體營養(yǎng)限制性培養(yǎng)基（0.4%葡萄糖，5×M9，1.5%瓊脂粉，2% 1 mol/L MgSO4，1% 0.1 mol/L CaCl2，1%微量元素，1%生長因子），其終質(zhì)量濃度分別為400、800、0.025、0.000 16μg/mL。將D（600 nm）=1.0的菌液以1∶100體積比添加到1 mL LB液體培養(yǎng)基中，取2 μL滴加在含有不同金屬離子的M9培養(yǎng)基上，于30 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)16 h后拍照，保存。上述實驗至少重復2次。

1.3.3 pH 脅迫

配制pH梯度分別為6.0、7.5和8.5的LB液體培養(yǎng)基。酸性培養(yǎng)基配制方法為在50 mL LB 液體培養(yǎng)基中加入1.07 g 2-（N-嗎啉代）乙磺酸（MES），混勻后用HCl 將pH 調(diào)至6.0。堿性培養(yǎng)基配制方法為在50 mL LB 液體培養(yǎng)基中分別加入1 g 3-（N-嗎啡啉）丙磺酸（MOPS）和1.1 g 3-[（1，1-二甲基-2-羥乙基）氨基]-2-羥基-1-丙磺酸（AMPSO），并用KCl 將pH 分別調(diào)至7.5 和8.5。上述培養(yǎng)基均經(jīng)高壓滅菌后保存，備用。將菌液按1∶100 體積比添加到各pH 梯度培養(yǎng)基中，然后將混合菌液按每孔300 μL 加入96 孔板進行培養(yǎng)，最后利用全自動生長曲線分析儀（芬蘭Bioscreen 公司）進行測定。每個pH 重復3 次，每小時測定一次并記錄數(shù)據(jù)，連續(xù)培養(yǎng)16 h。

1.3.4 H2O2脅迫

將菌液以1∶100體積比添加到1 mL LB液體培養(yǎng)基中，加入終濃度為2.5 mmol/L 的H2O2，振蕩混勻并在室溫條件下靜置10 min，吸取2 μL 滴在LB固體培養(yǎng)基平板上，在30 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)16 h，觀察結(jié)果并拍照，保存。

1.4 數(shù)據(jù)分析

通過STRING 在線網(wǎng)站（https://string-db.org/）構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用預測網(wǎng)絡(luò)，并結(jié)合實驗中的表型結(jié)果，利用Cytoscape 3.6.1 軟件實現(xiàn)可視化[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 敲除菌株的驗證

本研究利用同源重組敲除技術(shù)對33株菌的外膜蛋白基因進行敲除，并利用P5/P6引物對目的條帶進行擴增，部分結(jié)果如圖1所示。野生型菌株在相應(yīng)位置有一條明亮的條帶；而ΔAHA_2991、ΔAHA_0569、ΔAHA_3509和ΔAHA_0521等菌株在對應(yīng)位置無條帶，說明它們的外膜蛋白基因均被成功敲除（其余基因的敲除結(jié)果已發(fā)表[7]）。

圖1 野生型菌株與部分外膜蛋白基因敲除菌株的PCR 擴增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of wild type (WT) strain and partial OMP gene knockout strains

2.2 滲透壓脅迫檢測結(jié)果

為了解嗜水氣單胞菌外膜蛋白在不同滲透壓脅迫下的功能，對構(gòu)建的33個外膜蛋白基因敲除菌株進行了鹽脅迫研究。以1%NaCl 作為對照，分別測定了野生型菌株與敲除菌株在0.5%、3%、4%NaCl條件下的生長情況。如圖2所示，在4%NaCl條件下，ΔlptD（19）、ΔAHA_0904（23）、ΔAHA_0461（25）和ΔAHA_4275（28）菌株與野生型菌株相比具有更高的鹽脅迫耐受性，而在其他NaCl質(zhì)量分數(shù)條件下無明顯區(qū)別。

圖2 野生型菌株與外膜蛋白基因敲除菌株在不同質(zhì)量分數(shù)NaCl條件下的測定結(jié)果Fig.2 Determination results of WT strain and OMP gene knockout strains under different concentrations of NaCl

2.3 pH 脅迫檢測結(jié)果

為研究嗜水氣單胞菌外膜蛋白在應(yīng)對pH 脅迫時的表型變化，分別檢測了野生型和33株外膜蛋白基因敲除菌株在pH 為6.0、7.5 和8.5 條件下的生長趨勢。如圖3 所示，在3 種pH 條件下，ΔAHA_0461菌株的生長均好于野生型菌株，而ΔAHA_4275菌株則均略弱于野生型菌株；其余菌株生長狀態(tài)與野生型相比無明顯差異。

圖3 野生型菌株與外膜蛋白基因敲除菌株在不同pH條件下的生長情況Fig.3 Growth status of WT strain and OMP gene knockout strains under different pH conditions

2.4 H2O2脅迫檢測結(jié)果

如圖4 所示：在2.5 mmol/L H2O2脅迫條件下，ΔAHA_1279（7）、ΔAHA_1281（8）、ΔAHA_2145（10）、ΔpilQ（16）、ΔbamA（17）、ΔAHA_0461（25）和ΔAHA_0569（32）菌株的生長狀態(tài)與野生型菌株相比都有不同程度的削弱，其中以ΔpilQ（16）和ΔbamA（17）菌株最為明顯；其余菌株的生長狀態(tài)與野生型相似。

圖4 野生型菌株與外膜蛋白基因敲除菌株在不同H2O2濃度下的生長情況Fig.4 Growth status of WT strain and OMP gene knockout strains under different concentrations of H2O2

2.5 金屬離子脅迫檢測結(jié)果

為研究嗜水氣單胞菌外膜蛋白在應(yīng)對不同金屬離子脅迫下的作用，本實驗比較了在Fe3+（FeCl3）、Zn2+（ZnCl2）、Cr6+（K2Cr2O7）和Co2+（CoCl2）4 種金屬離子脅迫條件下野生型與敲除菌株的生長情況。如圖5 所示：在ZnCl2處理條件下，ΔAHA_2766（5）、ΔAHA_1279（7）、ΔAHA_2282（11）和ΔompW（14）菌株的生長較野生型菌株受到明顯抑制；在K2Cr2O7和CoCl2處理條件下，ΔAHA_2145（10）和ΔAHA_2282（11）菌株的生長較野生型菌株受到抑制；而在FeCl3處理條件下，33個外膜蛋白基因缺失菌株與野生型菌株相比沒有明顯差異。

圖5 野生型菌株與外膜蛋白基因敲除菌株在不同金屬離子脅迫下的生長情況Fig.5 Growth status of WT strain and OMP gene knockout strains under different metal ion stresses

2.6 蛋白質(zhì)相互作用預測結(jié)果分析

綜合以上研究結(jié)果與STRING 軟件預測，對外膜蛋白缺失菌株受pH、H2O2、金屬離子及滲透壓脅迫表型進行匯總，并對33個外膜蛋白互作網(wǎng)絡(luò)進行預測。結(jié)果（圖6）表明，除AHA_0389、AHA_2202和AHA_2699 外，其余外膜蛋白都參與了蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)，說明嗜水氣單胞菌的外膜蛋白具有復雜的蛋白質(zhì)互作調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

圖6 33個外膜蛋白互作網(wǎng)絡(luò)預測結(jié)果及其響應(yīng)環(huán)境脅迫表型匯總Fig.6 Prediction results of interaction networks of 33 OMPs and summary of the phenotypes responding to environmental stresses

3 討論

外膜蛋白在革蘭氏陰性細菌的生命活動中起著至關(guān)重要的作用。目前，研究者已通過遺傳、生化和結(jié)構(gòu)分析等方法對許多典型的外膜蛋白進行了詳細的研究[8]，但是關(guān)于外膜蛋白在魚類病原菌嗜水氣單胞菌中的生物學特性的報道很少。本研究對嗜水氣單胞菌中33 個外膜蛋白基因敲除菌株在不同環(huán)境脅迫下的表型進行了較為系統(tǒng)的研究。結(jié)果顯示，一些外膜蛋白基因敲除菌株在不同環(huán)境條件下表型發(fā)生了變化，提示這些外膜蛋白在相應(yīng)環(huán)境脅迫中具有重要的生物學功能。

溫度和pH 等物理化學條件可以對膜蛋白的功能及營養(yǎng)物質(zhì)的擴散等產(chǎn)生影響，從而破壞膜的完整性。在pH 為6.0、7.5 和8.5 脅迫條件下，ΔAHA_0461菌株的生長強于野生型，而ΔAHA_4275菌株弱于野生型。AHA_0461和AHA_4275都屬于TonB依賴性受體家族蛋白（TonB-dependent receptors,TBDRs），該家族蛋白可以結(jié)合并轉(zhuǎn)運少量但重要的營養(yǎng)物質(zhì)，并會影響抗性因子及毒力因子的產(chǎn)生及運輸[9]，這可能是ΔAHA_0461和ΔAHA_4275菌株表型的生長區(qū)別于野生型菌株的原因之一。

ΔlptD、ΔAHA_0904、ΔAHA_0461和ΔAHA_4275菌株在4% NaCl 脅迫條件下較野生型菌株生長更好。AHA_0904編碼了未知功能的蛋白質(zhì)，其具體功能尚需進一步研究。LptD是一種β-桶狀外膜蛋白，在大腸埃希菌中LptD和LptE的突變會導致其外膜的通透性增加[10]；本研究結(jié)果與其在大腸埃希菌中的報道并不完全一致，說明該基因在適應(yīng)環(huán)境脅迫等方面還起到了其他的作用。AHA_0461和AHA_4275所屬的TonB家族蛋白可以對抗性因子及毒力分子的轉(zhuǎn)運產(chǎn)生影響[9]，它們對pH 脅迫、鹽脅迫和H2O2脅迫都能夠產(chǎn)生響應(yīng)，說明TonB系統(tǒng)可能在維持嗜水氣單胞菌細胞穩(wěn)態(tài)中起重要的作用。

氧化應(yīng)激作為一種對環(huán)境脅迫的響應(yīng)會對細菌細胞造成影響，使其生長速率降低，在極端環(huán)境下還會造成細胞死亡。而外膜蛋白為革蘭氏陰性細菌抵御外界環(huán)境變化的第一道防線，可能在響應(yīng)氧化應(yīng)激環(huán)境等方面發(fā)揮作用。在H2O2處理條件下，ΔAHA_1279、ΔAHA_1281、ΔAHA_2145、ΔpilQ、ΔbamA、ΔAHA_0461和ΔAHA_0569菌株的生長與野生型菌株相比都有不同程度的減弱。研究表明，長鏈脂肪酸在細菌感染過程中起到適應(yīng)外界環(huán)境的作用，并能夠幫助細胞對應(yīng)激條件產(chǎn)生一定的耐受性[11]。AHA_2145編碼長鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運蛋白，該蛋白的缺失可能導致嗜水氣單胞菌在H2O2脅迫和金屬離子脅迫條件下生長緩慢。AHA_1279和AHA_1281同屬于OmpA 家族蛋白基因，該家族蛋白具有維持細胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的功能[12]，H2O2則可能通過影響細胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性而影響細菌的生長狀態(tài)。pilQ和AHA_0569分別編碼分泌素家族蛋白。蛋白質(zhì)分泌系統(tǒng)為細菌生長所必需，敲除編碼分泌素家族蛋白基因不利于運輸通道對脅迫因子進出的控制，從而使細菌生長受到影響。BamA（AHA_1181）可參與細菌膜蛋白的插入及分泌[13]，H2O2能夠攻擊細菌的細胞膜，從而對膜上的β-桶狀結(jié)構(gòu)造成破壞[14]。因此，BamA的缺失不利于嗜水氣單胞菌抵御外界環(huán)境脅迫，從而造成該菌生長狀態(tài)的異常。

地球環(huán)境的多樣性導致局部區(qū)域的金屬元素含量不平衡，也迫使周圍微生物的生長代謝發(fā)生適應(yīng)性改變。在大多數(shù)細菌中，銅、鎘或鎂等金屬可通過細胞膜上的特異性通道進行運輸，并存在代謝胞內(nèi)多余金屬離子的機制[15]。在ZnCl2、K2Cr2O7和CoCl2脅迫條件下，ΔAHA_2766、ΔAHA_1279、ΔAHA_2282、ΔompW（ΔAHA_3953）和ΔAHA_2145菌株的生長均弱于野生型菌株。AHA_2282和AHA_0904編碼未知功能的蛋白質(zhì)，它們分別響應(yīng)金屬離子和滲透壓的脅迫，因而可能參與了嗜水氣單胞菌對環(huán)境脅迫的適應(yīng)過程。AHA_1279（ompAⅡ）作為ompA的等位基因，可能也具有維持細胞外膜穩(wěn)態(tài)和離子通道活性的作用[16]，這或許是ΔAHA_1279菌株在Zn2+處理條件下生長較弱的原因。AHA_2766與創(chuàng)傷弧菌MtrB/PioB家族中血紅素相關(guān)外膜蛋白具有氨基酸序列同源性。MtrB/PioB家族蛋白具有Fe（Ⅲ）和Mn（Ⅳ）還原以及細胞外電子轉(zhuǎn)移等功能[17]。本研究結(jié)果提示，MtrB 的同源蛋白AHA_2766可能也具有電子轉(zhuǎn)移的功能。AHA_3953編碼OmpW家族蛋白。研究表明，革蘭氏陰性菌中的小孔蛋白OmpW參與了鐵轉(zhuǎn)運、膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定以及應(yīng)激適應(yīng)等生理過程[18]。但在本實驗中，OmpW 突變株對高濃度鐵脅迫環(huán)境并不敏感，因而推測OmpW家族蛋白在嗜水氣單胞菌中可能具有獨特的功能。此外，ΔAHA_3953菌株在Zn2+脅迫條件下的生長較弱，表明OmpW 作為小孔蛋白可能也參與了Zn2+的運輸。

綜上所述，外膜蛋白作為保護細菌內(nèi)穩(wěn)態(tài)的屏障，在營養(yǎng)物質(zhì)運輸、離子運輸、毒力因子的分泌、環(huán)境抗逆性以及抗生素耐藥性等方面都具有重要的作用。本研究通過對33 個嗜水氣單胞菌外膜蛋白缺失菌株生理表型的系統(tǒng)分析，發(fā)現(xiàn)多個外膜蛋白在響應(yīng)不同的環(huán)境脅迫條件中具有重要的作用。本研究結(jié)果有助于深入了解外膜蛋白的生理功能，并為今后全面地了解細菌外膜蛋白的生物學功能奠定了科學基礎(chǔ)。