黃天志 張媚 張細六 蔡真 (武漢市第五醫(yī)院神經(jīng)內科,湖北 武漢 430050)
帕金森病(PD)以黑質多巴胺(DA)能神經(jīng)元缺失為主要病理特征〔1〕。60歲以上人群發(fā)病率大約1%,患病率隨年齡的增加而增長,PD患病原因未知,目前尚無減緩神經(jīng)退化過程的治療方法〔2〕。研究PD發(fā)生和發(fā)展的分子機制,為其治療提供分子靶點,是該疾病目前研究的重點。
研究表明,miRNA參與包括PD在內的多種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機制,miRNA可能是PD的診斷標志物,靶向特定的miRNA也可作為PD的潛在靶向治療策略〔3〕。miR-325-3p在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜〔4〕和心肌梗死大鼠的心肌組織〔5〕中均表達下調,通過不同方式上調miR-325-3p可對2型糖尿病大鼠視網(wǎng)膜起保護作用,減弱心肌組織的損傷程度。而本研究通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn),S100B可能是miR-325-3p的靶基因。S100在阿爾茨海默病(AD)患者血清中含量顯著升高,與AD患者認知損傷程度相關〔6〕。S100B很可能是參加PD發(fā)生發(fā)展的重要蛋白,抑制其過表達有可能為臨床PD的治療提供新的研究思路和方向〔7〕。兩者在PD模型細胞中的作用和關系尚不清楚。本研究通過以不同濃度的1-甲基-4-苯基吡啶陽離子(MPP+)處理SK-N-SH細胞24 h的方式建立PD細胞模型,以上調miR-325-3p和下調S100B表達的方法來檢測兩者對PD模型細胞損傷的影響。
1.1材料 SK-N-SH(人神經(jīng)母細胞瘤)細胞購自ATCC;杜氏改良培養(yǎng)基(DMEM)高糖培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司,MPP+、胰蛋白酶Trypsin購自Sigma-Aldrich公司;S100B抗體、B細胞淋巴瘤(Bcl)-2抗體、Bcl-2相關X蛋白(Bax)抗體和活化的半胱氨酸蛋白酶(cleaved-caspase)3抗體和抗GAPDH抗體購自英國Abcam公司;總RNA提取試劑盒、 real-time PCR 試劑盒、反轉錄試劑盒(RT-PCR)購自寶生物工程(大連)有限公司;Lipofectamine2000轉染試劑購自美國Invitrogen公司;丙二醛(MDA)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司;流式法細胞凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司;引物、miR-325-3p模擬物(miR-325-3p)、miR-325-3p抑制劑(anti-miR-325-3p)、S100B干擾劑(si-S100B)、S100B過表達載體(pcDNA-S100B)、陰性對照(miR-NC、si-NC、anti-miR-NC和pcDNA)、S100B的野生型和突變型雙熒光素酶載體購自上海吉瑪基因;流式細胞儀購自美國BD公司,光學顯微鏡、全自動酶標儀及Real-time PCR儀購自美國Bio-rad公司。
1.2方法
1.2.1細胞培養(yǎng) 將SK-N-SH細胞培養(yǎng)在含10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基中(含100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素),于飽和濕度、5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。待細胞生長融合成單層時,用胰蛋白酶消化傳代。
1.2.2PD細胞模型建立〔7〕取對數(shù)生長期的SK-N-SH細胞進行模型建立。分為Con組:SK-N-SH細胞正常培養(yǎng);MPP+組:培養(yǎng)液中加入終濃度為100 μmol/L的MPP+,繼續(xù)培養(yǎng)24 h。MPP++轉染組:加入終濃度為100 μmol/L的MPP+誘導24 h后進行轉染。
1.2.3細胞轉染 將加入MPP+后培養(yǎng)24 h的SK-N-SH細胞,稀釋為1×106個細胞/ml,以每孔200 μl(1×105個/孔)接種于6孔板中,培養(yǎng)至細胞融合度達到80%時按照Lipofectamine2000說明書進行轉染。轉染分組:miR-325-3p過表達組(轉染miR-NC和miR-325-3p),S100B抑制組(轉染si-NC和si-S100B),miR-325-3p抑制組(轉染anti-miR-NC和anti-miR-325-3p),miR-325-3p和S100B過表達組(轉染miR-325-3p+pcDNA和miR-325-3p+pcDNA-S100B),S100B野生型和突變型雙熒光素酶報告系統(tǒng)(轉染miR-NC+WT-S100B、miR-325-3p+WT-S100B、miR-NC+MUT-S100B和miR-325-3p+MUT-S100B),將各載體或片段轉入MPP+誘導24 h的SK-N-SH細胞中,轉染48 h,驗證無誤進行后續(xù)實驗。
1.2.4Real-time PCR檢測RNA的表達 收集MPP+誘導和(或)轉染后的各組細胞,用總RNA提取試劑盒提取細胞總RNA,然后按照反轉錄試劑盒說明書合成cDNA,以cDNA為模板按照 real-time PCR的說明書進行反應合成S100B mRNA和miR-325-3p,反應程序為95℃ 5 min;94℃30 s、59℃ 45 s、72℃ 45 s,45個循環(huán);72℃ 5 min。用2-ΔΔCt方法進行數(shù)據(jù)分析。
1.2.5分光光度法檢測細胞中MDA和GSH-Px的含量 收集MPP+誘導和(或)轉染后的各組細胞,冰浴破碎細胞,離心后取上清,根據(jù)試劑盒說明書進行操作,計算MDA和GSH-Px含量。
1.2.6流式細胞術測定細胞凋亡率 收集MPP+誘導和(或)轉染后的各組細胞,以每孔2×104個細胞接種于6孔板中培養(yǎng)48 h,棄去培養(yǎng)液,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次,按照膜聯(lián)蛋白(Annexin)V/碘化丙啶(PI)試劑盒說明書進行操作,先加 200 μl結合緩沖液重懸細胞,然后加入5 μl Annexin V-異硫氰酸熒光素(FITC)和5 μl PI,混勻,室溫避光孵育15 min,加入300 μl結合緩沖液,用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。
1.2.7Western印跡檢測蛋白表達 收集MPP+誘導和(或)轉染后的各組細胞,冰浴超聲破碎細胞,離心收集蛋白,將蛋白樣本進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離,然后將蛋白條帶轉聚偏氟乙烯(PVDF)膜,室溫封閉2 h,加入稀釋的一抗S100B(1∶1 000)、Bcl-2抗體(1∶4 000)、Bax抗體(1∶3 000)、cleaved-caspase3抗體(1∶1 000)和GAPDH抗體(1∶5 000),4℃過夜孵育,含0.05% Tween20的中性洗滌緩沖液(PBST)洗膜2次,加入稀釋的酶標二抗,室溫孵育1 h,顯影,以GAPDH為內參照,分析蛋白表達水平。
1.3統(tǒng)計學處理 采用SPSS19.0軟件進行方差分析、t檢驗。
2.1miR-325-3p和S100B在MPP+誘導SK-N-SH細胞損傷中的表達 100 μmol/L的MPP+誘導SK-N-SH細胞可達到最好的效果,實驗均采用100 μmol/L MPP+誘導的SK-N-SH細胞(PD細胞)模型。結果顯示,與Con組相比,MPP+組誘導的SK-N-SH細胞中S100B mRNA和蛋白表達量均顯著升高(P<0.05),miR-325-3p表達量顯著下降(P<0.05),見圖1、表1。
圖1 Western印跡檢測S100B蛋白表達
表1 miR-325-3p和S100B在MPP+誘導SK-N-SH細胞損傷中的表達
2.2miR-325-3p過表達可減輕MPP+誘導的SK-N-SH細胞氧化損傷及凋亡 與Con組相比,MPP+組SK-N-SH細胞中miR-325-3p表達、GSH-Px含量、Bcl-2表達顯著下降,MDA含量、Bax、cleaved-caspase3蛋白表達、凋亡率顯著升高(均P<0.05);與MPP++miR-NC組相比,MPP++miR-325-3p組細胞中miR-325-3p表達、GSH-Px含量、Bcl-2表達顯著升高,MDA含量、Bax、cleaved-caspase3表達、凋亡率顯著降低(均P<0.05),見表2、圖2、圖3。
1~4:Con組、MPP+組、MPP++miR-NC組、MPP++miR-325-3p組圖2 Western印跡檢測凋亡相關蛋白表達
圖3 miR-325-3p過表達對MPP+誘導SK-N-SH細胞凋亡的影響
表2 miR-325-3p過表達對MPP+誘導SK-N-SH細胞氧化損傷及凋亡的影響
2.3干擾S100B表達對MPP+誘導SK-N-SH細胞損傷的影響 與Con 組相比,MPP+組SK-N-SH細胞的S100B蛋白表達、MDA含量和Bax蛋白表達顯著升高,GSH-Px含量和Bcl-2表達顯著下降,細胞凋亡率顯著升高(均P<0.05);與MPP++si-NC組相比,MPP++si-S100B組S100B蛋白表達、MDA含量和Bax蛋白表達顯著降低,GSH-Px含量和Bcl-2表達顯著上升,細胞凋亡率顯著降低(均P<0.05),見表3、圖4。
表3 干擾S100B表達對MPP+誘導SK-N-SH細胞損傷的影響
1~4:Con組、MPP+組、MPP++si-NC組、MPP++si-S100B組圖4 Western印跡檢測S100B和凋亡相關蛋白表達
2.4miR-325-3p靶向調控S100B的表達 Targetscan預測發(fā)現(xiàn),S100B的3′UTR中含有與miR-325-3p互補的序列,見圖5。雙熒光素酶報告系統(tǒng)結果顯示,與miR-NC組相比,過表達miR-325-3p組野生型WT-S100B的螢火蟲熒光素酶相對活性顯著下降(P<0.05);而突變型MUT-S100B的熒光素酶相對活性無顯著變化,見表4。Western印跡結果表明,與miR-NC組(0.40±0.04)相比,過表達miR-325-3p可使S100B表達量顯著下降(0.23±0.02,P<0.05);與anti-miR-NC組(0.38±0.04)相比,抑制miR-325-3p表達可上調S100B表達量(0.83±0.08,P<0.05),見圖6。
圖5 S100B的3′UTR中含有與miR-325-3p互補的核苷酸序列
圖6 Western印跡檢測S100B蛋白表達
表4 雙熒光素酶報告實驗
2.5S100B過表達逆轉了miR-325-3p過表達對MPP+誘導SK-N-SH細胞損傷的作用 與MPP++miR-NC組相比,MPP++miR-325-3p組的SK-N-SH細胞中S100B蛋白表達、MDA含量和Bax蛋白表達顯著下降,GSH-Px含量和Bcl-2蛋白表達顯著升高,細胞凋亡率顯著降低(P<0.05);與MPP++miR-325-3p+pcDNA組相比,MPP++ miR-325-3p+pcDNA-S100B組SK-N-SH細胞中S100B蛋白表達、MDA含量和Bax蛋白表達顯著升高,GSH-Px含量和Bcl-2蛋白表達顯著降低,細胞凋亡率顯著升高(均P<0.05),見圖7、表5。
1~4:MPP++miR-NC組、MPP++miR-325-3p組、MPP++miR-325-3p+pcDNA組、MPP++miR-325-3p+pcDNA-S100B組圖7 Western印跡檢測S100B和凋亡相關蛋白表達
表5 S100B過表達逆轉了miR-325-3p過表達對MPP+誘導SK-N-SH細胞損傷的作用
miRNA參與PD的發(fā)病機制,幾乎所有與PD相關的基因都是由miRNA調控的,血清和腦脊液來源外泌體中穩(wěn)定存在的miRNA也使其可能成為PD的可靠診斷工具,調節(jié)miRNA的水平可能是PD靶向治療的新策略〔8〕。S100B是由星形膠質細胞產(chǎn)生的,對神經(jīng)元和膠質細胞具有旁分泌和自分泌作用,S100B根據(jù)其濃度發(fā)揮營養(yǎng)或毒性作用,低濃度下(nmol濃度)S100B刺激軸突的生長,提高神經(jīng)元在發(fā)育過程中的存活率;細胞外高濃度(μmol濃度)S100B在體外刺激促炎細胞因子的表達并誘導細胞凋亡;而在腦損傷、缺血、神經(jīng)退行性、炎癥和精神疾病中S100B均會增加〔9〕。S100B在PD患者腦脊液中水平升高,在PD死亡患者的黑質中表達上調,體內小鼠實驗也表明,S100B的消融導致神經(jīng)保護、微膠質增生和晚期糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE)和腫瘤壞死因子(TNF)-α的表達降低〔10〕。夜間S100B和早晨S100B的變化與PD的嚴重程度和睡眠中斷有關,S100B被認為是PD患者睡眠相關神經(jīng)炎癥的生物標志物〔11〕。S100B基因3′-非編碼區(qū)(UTR)的一個功能性單核苷酸多態(tài)性rs9722,與PD發(fā)病年齡密切相關〔12〕。本研究與上述研究結果類似〔10〕。以上研究結果均表明,靶向S100B可能是PD的潛在治療策略。
本研究通過TargetScan預測發(fā)現(xiàn),S100B 的3′-UTR中含有與miR-325-3p互補的序列,S100B可能是miR-325-3p的靶基因。在低氧缺血性腦損傷(HIBD)中,miR-325-3p是松果體芳烷基胺N-乙酰轉移酶(Aanat)的靶基因,miR-325-3p上調可抑制新生大鼠HIBD后Aanat的表達,減輕HIBD的損害〔13〕。在大鼠垂體前葉細胞中,尿質皮素(UCN)2可促進miR-325-3p的表達,并參與應激誘導的大鼠垂體促黃體生成素(LH)分泌抑制〔14〕。在脊髓損傷(SCI)中,miR-325-3p通過抑制表皮生長因子受體/絲裂原活化蛋白激酶(EGFR/MAPK)信號通路,激活小膠質細胞,釋放炎癥因子,減輕SCI后繼發(fā)性損傷,提示miR-325-3p可以作為SCI的治療靶點〔15〕。說明miR-325-3p參與腦和脊髓等神經(jīng)功能過程,但其在PD中尚未被研究。本研究發(fā)現(xiàn),miR-325-3p在MPP+誘導的SK-N-SH細胞(PD模型)中表達顯著下降,過表達miR-325-3p減輕MPP+誘導的PD模型細胞氧化損傷,抑制細胞凋亡。通過雙熒光素酶報告系統(tǒng)和Western印跡發(fā)現(xiàn),miR-325-3p靶向負調控S100B的表達,過表達S100B則會逆轉上調miR-325-3p對MPP+誘導的PD模型細胞氧化損傷和凋亡的影響作用,證實了在PD模型細胞中miR-325-3p與S100B之間具有調控關系。
綜上,PD細胞模型中miR-325-3p通過靶向抑制S100B的表達,減輕PD模型細胞氧化損傷,抑制細胞凋亡。說明miR-325-3p和S100B是PD的潛在分子靶點,對PD的治療和診斷具有重要的指導作用。