王恒 吉楊丹 唐慧敏 覃建鋒 梁子聰 胡先運，2 孟鐵宏

(1黔南民族醫(yī)學高等專科學校，貴州 都勻 558003；2貴州醫(yī)科大學天然產(chǎn)物化學重點實驗室)

交感神經(jīng)系統(tǒng)的激活在心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展方面具有重要的作用，甚至認為交感神經(jīng)系統(tǒng)的激活是心室肥厚的中心環(huán)節(jié)。去甲腎上腺素(NE)是其主要的交感神經(jīng)遞質(zhì)。研究報道在體內(nèi)外實驗中，NE可以模擬出心室肥厚的許多特征，如心肌細胞肥大、凋亡及損傷壞死〔1〕等。

Notch信號由受體Notch 1～4、配體Jagged1/2及靶分子Hes-1組成〔2〕。研究證實心血管系統(tǒng)的發(fā)育及多種心血管疾病的發(fā)展，均與Notch-1信號通路有著密切的聯(lián)系〔3〕。文獻表明轉化生長因子β1能夠激活心血管系統(tǒng)中Notch通路，調(diào)控心臟內(nèi)皮細胞的增殖與分化〔4〕，且通過調(diào)控Notch-1信號可以抑制轉化生長因子β1誘導的心肌成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化〔5〕。在醛固酮誘導的大鼠慢性心力衰竭模型中，Notch-1信號也起到關鍵作用。然而，Notch-1信號在高交感活性誘導的大鼠心肌損傷過程中的作用，目前尚未見文獻報道。

氧化苦參堿(OMT)是從中藥苦參中提取的喹嗪烷類生物堿，藥理作用廣泛。研究資料證實，OMT對多種心血管疾病具有良好的療效，具有強心、降壓、抗心律失?！?〕、對心肌缺血和梗死有保護作用〔7〕，可通過保護線粒體，改善心肌能量代謝〔8〕，減少心肌細胞凋亡，逆轉心室重構，改善病毒性心肌炎小鼠心力衰竭〔9〕。前期研究表明，OMT對醛固酮誘導的心肌損傷具有保護作用〔10〕，可以通過調(diào)控Notch-1信號改善轉化生長因子β1誘導的心肌成纖維細胞增殖及異常分化〔11〕。然而，OMT對高交感活性誘導的大鼠心室肥厚模型中Notch-1信號的影響尚未可知。本研究旨在探索OMT對高交感活性誘導的大鼠心室肥厚的保護作用及其與Notch-1信號的關系。

1 資料與方法

1.1動物 健康雄性SD大鼠50只，體重210～230 g，購自貴州醫(yī)科大學實驗動物中心，合格證號SCXK(黔)2018-0001。

1.2儀器 DS-671電子計重秤(上海寺岡電子有限公司)，722G可見分光光度計(上海儀電分析儀器有限公司)，游標卡尺(桂林廣陸書記測控有限公司)，BL-420S生物信號采集與分析系統(tǒng)(成都泰盟軟件有限公司)，PT-100生物血壓傳感器(成都泰盟軟件有限公司)，qPCR儀(Applied biosystems)，電泳儀(biorad)，凝膠成像儀(biorad)，核酸濃度測定儀(Thermo)。

1.3藥物與試劑 氧化苦參堿(南京廣潤生物制品有限公司，批號GR133151019)，重酒石酸NE(上海禾豐制藥有限公司，批號08200603)，鹽酸普萘洛爾(天津力生制藥有限公司，批號1909003)，氯化鈉注射液(貴州科倫藥業(yè)有限公司，批號D15052102)，水合氯醛(Solarbio，批號811B0215)，羥脯胺酸試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號20180618)，Trizol(Invitrogen，批號10296028)，DEPC水(MDL，批號md911875)，SuperScript Ⅲ RT 反轉錄kit(ABI-invitrogen，批號11752050)，Sybr qpcr mix(ABI-invitrogen，批號4472920)，Ultrapure Agarose(ABI-invitrogen，批號16500100)。

1.4動物分組、造模與給藥 實驗分5組，每組10只。即對照組、模型組、OMT高劑量組(50 mg/kg)、OMT低劑量組(25 mg/kg)、普萘洛爾組(50 mg/kg)。各組于造模前1 w開始灌胃給藥，對照組及模型組給予等體積蒸餾水，腹腔注射NE 3 mg/(kg·d)復制心肌損傷模型(對照組給予等體積生理鹽水)。

1.5大鼠血壓指標變化 末次給藥1 h后腹腔注射3%水合氯醛10 ml/kg進行麻醉，背位固定于手術臺上。分離右側頸總動脈，插入動脈插管，穩(wěn)定30 min后，記錄大鼠收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)和平均動脈壓(MAP)。

1.6心室重構參數(shù) 處死大鼠，取出心臟，游標卡尺測量心長軸(HL)、左心室內(nèi)徑(LVD)、左室前壁厚度(LVAW)，計算重構參數(shù)(HL/LVD，LVAW/LVD)。

1.7心肌羥脯胺酸含量檢測 稱取100 mg心肌組織，加入1 ml水解液，95℃水浴20 min使其水解，之后嚴格按照試劑盒說明書操作，檢測羥脯胺酸含量。

1.8qRT-PCR法檢測Notch-1信號 稱取100 mg心肌組織，置于RNA儲存液中，4℃保存。根據(jù)試劑盒說明書提取總RNA后，反轉錄合成cDNA，按照兩步法PCR擴增標準程序95℃ 2 min、94℃ 20 s、60℃ 20 s、72℃ 30 s進行40個循環(huán)的擴增，檢測Notch-1、Jagged-1、Hes-1的基因表達，以GAPDH為內(nèi)參基因，采用CFX-Manager軟件分析，引物序列：GAPDH上游引物：GTTACCAGGGCTGCCTTCTC、下游引物：GGGTTTCCCGTTGATGACC；Notch-1上游引物：TGC-GTGGACAAGATCAACGA、下游引物：GGTCCCCGTGTAACCTTCTG；Jagged-1上游引物：CAAATGAGTGCGAGGCCAAG、下游引物：AACCAAATCCCGACAGGAGG；Hes-1上游引物：CAACACGACACCGGACAAAC、下游引物：GGAATGCCGGGAGCTATCTT。

1.9統(tǒng)計學方法 采用SPSS20.0軟件進行F檢驗，用Student-t檢驗進行組間分析。

2 結 果

2.1OMT對高交感活性誘導大鼠血壓的影響 NE造模后，模型組血壓較對照組顯著升高(P<0.05)，與模型組比較，各給藥組SBP、DBP及MAP均有不同程度降低，差異顯著(均P<0.05)。見表1。

表1 OMT對高交感活性誘導大鼠血壓的影響

2.2OMT對高交感活性誘導大鼠心室重構參數(shù)的影響 與對照組比較，模型組HL/LVD與LVAW/LVD顯著升高(均P<0.05)，與模型組比較，各給藥組HL/LVD與LVAW/LVD顯著降低(均P<0.05)。見表2。

表2 OMT對高交感活性誘導大鼠心室重構參數(shù)的影響

2.3OMT對高交感活性誘導大鼠心肌羥脯胺酸含量的影響 與對照組〔(175.23±11.88)μg/g〕比較，模型組心肌組織羥脯胺酸含量〔(218.34±10.52)μg/g〕顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，OMT高劑量組〔(180.46±15.33)μg/g〕、OMT低劑量組〔(186.10±17.81)μg/g〕、普萘洛爾組心肌羥脯胺酸含量〔(180.44±9.89)μg/g〕顯著降低(P<0.05)。

2.4OMT對高交感活性誘導大鼠心肌組織Notch-1信號mRNA表達的影響 與對照組比較，模型組心肌組織中Notch-1，Jagged-1及Hes-1 mRNA表達均顯著增高(P<0.05)。與模型組比較，OMT各劑量組及普萘洛爾組Notch-1，Jagged-1及Hes-1 mRNA表達均顯著降低(均P<0.05)。見表3。

表3 OMT對高交感活性誘導大鼠心肌組織Notch-1信號mRNA表達的影響

3 討 論

心血管系統(tǒng)疾病是全球范圍內(nèi)危及人類生命和健康的“頭號殺手”，是當今世界威脅人類最嚴重的疾病之一。且隨著人們的生活方式和飲食結構的變化，社會老齡化程度的增加，心血管疾病患者呈現(xiàn)出年輕化的趨勢，并且嚴重威脅著人類的生活質(zhì)量和壽命。

心血管系統(tǒng)疾病往往是由于交感神經(jīng)系統(tǒng)過度活躍及副交感神經(jīng)系統(tǒng)反應異常低下所致〔12〕。NE是體內(nèi)主要的交感神經(jīng)遞質(zhì)和內(nèi)分泌激素，其在血漿中的濃度高低很大程度上反映了交感神經(jīng)興奮狀態(tài)。而交感神經(jīng)活性的增加會改變自主神經(jīng)平衡，進一步增加心臟的不穩(wěn)定性，導致惡性心血管事件的發(fā)生。NE在心肌肥厚、心力衰竭等病理過程中起重要作用，是公認的心肌肥厚因子〔13〕。

血壓是心血管系統(tǒng)的基本檢測指標，代表血液對血管壁的側壓力。正常血壓是保證各系統(tǒng)血液正常供應的基礎。本研究結果說明OMT和普萘洛爾可以降低心肌耗氧量，降低血管外周阻力和心室后負荷。

心室重構參數(shù)是反映心室肥厚的指標。本研究結果提示HE造模后大鼠發(fā)生了心室肥厚，OMT對NE引起的心室肥厚有改善作用。

羥脯胺酸是膠原蛋白的特征性氨基酸，其含量變化反映膠原含量的變化。本研究結果提示NE使大鼠心肌膠原沉積增多，纖維化程度加重。OMT和普萘洛爾可以降低NE引起的心肌膠原沉積，減弱纖維化程度。

近年來Notch-1信號與心血管疾病的關系越來越受到人們的重視，對于Notch信號的研究主要集中在其受體(Notch-1)、配體(Jagged)和下游靶基因(Hes-1)上。本研究結果說明NE誘導大鼠心室肥厚模型中Notch-1信號表達上調(diào)；OMT和普萘洛爾改善NE誘導的大鼠心室肥厚可能與降低Notch-1信號的mRNA表達存在相關性。

綜上，高交感活性引起心室肥厚的病理過程復雜，涉及多因素、多靶點、多通道。本研究結果提示，在高交感活性誘導大鼠心室肥厚模型中，大鼠血壓升高、心室重構、纖維化伴隨Notch-1信號的mRNA表達上調(diào)。OMT對高交感活性誘導的大鼠心室肥厚有改善作用，可能與降低Notch-1信號的mRNA表達有關。