賀洪洲，陳 萍，梁 華，李太軍，李小榮

(內(nèi)江市第一人民醫(yī)院甲狀腺乳腺外科，四川 內(nèi)江 641000)

乳腺癌是女性常見的癌癥類型，全世界每年有超過150萬女性被診斷出患有乳腺癌，占女性所有癌癥的25%[1]。乳腺癌通常從導管過度增殖開始，在各種致癌因素的不斷刺激下發(fā)展為良性腫瘤，后續(xù)形成轉(zhuǎn)移癌，且可以轉(zhuǎn)移到骨、肝、肺和腦等遠處器官，導致無法治愈[2-3]。近年來，乳腺癌的理論與臨床研究均取得了很大進展，患者的病死率也有所下降,但據(jù)統(tǒng)計乳腺癌仍然是20～59歲女性癌癥死亡的首要原因。

DNA結(jié)合分化抑制蛋白-1(inhibitors of DNA binding-1，ID-1)是一種螺旋—環(huán)—螺旋(helix-loop-helix,HLH)蛋白，可與HLH家族轉(zhuǎn)錄因子成員形成異源二聚體，其編碼的蛋白質(zhì)沒有DNA結(jié)合活性，但會抑制與其相互作用的HLH蛋白質(zhì)的DNA結(jié)合及轉(zhuǎn)錄[4]。ID-1參與細胞生長、衰老和分化過程，并且與多種腫瘤的發(fā)生及轉(zhuǎn)移具有相關性[5-6]。已有研究表明，ID-1 mRNA在乳腺癌組織中高表達，且其與患者的無病生存率和總體生存率呈負相關[7]。鑒于此，本研究通過建立抑制或過表達ID-1的乳腺癌細胞系，經(jīng)體外實驗探究ID-1是否參與調(diào)控乳腺癌細胞干細胞特性及血管形成，并探討其分子機制，以期為乳腺癌的治療提供新的靶標。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集2019年6月至2020年12月在我院進行手術切除治療的女性乳腺浸潤性癌(非特指型)患者的癌組織與癌旁組織標本共42例?；颊吣挲g29～68歲，平均(46.58±4.50)歲。所有患者的臨床、病理資料均完整，術前均未接受放療、化療、免疫制劑治療等，未患其他腫瘤或重大疾病。按2019版WHO乳腺腫瘤分類標準[8]對患者進行分級分期：Ⅰ級3例、Ⅱ級29例、Ⅲ級10例；TNM分期：Ⅰ期4例、Ⅱ期31例、Ⅲ期 7例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者31例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者11例。本研究已通過我院醫(yī)學倫理委員會批準(審批號：20190528128)，組織標本收集前患者或家屬均知情同意。

1.2 主要材料與試劑

人乳腺癌細胞系SUM159和人臍靜脈內(nèi)皮細胞HUVECs(中科院上海細胞庫)，Ham’s F-12K培養(yǎng)液、青霉素、鏈霉素及胰蛋白酶(美國HyClone公司)，Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒和Trizol試劑盒(美國Invitrogen公司)，SensiFast cDNA合成試劑盒和SensiFastTMSYBR Hi-ROX試劑盒(美國Meridian公司)，腫瘤細胞球誘導因子(美國Sigma公司)，細胞培養(yǎng)板和Matrigel膠(美國Corning 公司)，PVDF膜(瑞氏Roche公司)，結(jié)晶紫染液、DAB免疫組織化學染色試劑盒和BeyoECL Plus試劑盒(上海碧云天生物研究所)，免疫熒光染色試劑盒(南京博恩生物公司)，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔和異硫氰酸熒光素熒光標記的小鼠抗兔(北京博奧森公司)，ID-1、p-Src、Src及GAPDH抗體(英國Abcam公司)，shRNA-NC、shRNA-ID-1、pcDNA3.1-NC和pcDNA3.1-ID-1質(zhì)粒以及引物序列均由廣州銳博生物公司構建合成。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學染色 將收集的乳腺癌組織及癌旁組織置于4%多聚甲醛中，室溫固定過夜，制備蠟塊，切成厚度為4 μm的切片。65 ℃烤箱內(nèi)烤片2 h，二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，流水沖洗后，置于枸櫞酸緩沖液煮沸15 min修復抗原，冷卻后，通過3%過氧化氫去離子水溫育10 min去除內(nèi)源性過氧化氫酶活性，再以10%山羊血清于37 ℃下封閉非特異性抗原30 min。加入一抗工作液，4 ℃共孵育過夜，次日，棄去一抗工作液，加入對應二抗，37 ℃孵育40 min，PBS清洗后，利用DAB顯色液顯色，蘇木素復染，1%鹽酸酒精分色3 s，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，普通光學顯微鏡下觀察并攝取圖片。ID-1主要表達于細胞質(zhì)，著色顯示棕黃色至棕色顆粒表示陽性。陽性細胞率評分：≤5%記0分，6%～25%記 1分，26%～50%記2分，51%～75%記3分，≥76%為 4分；染色強度評分：無色記0分，黃色記1分，棕黃色記2分，棕色至棕褐色記3分。兩項指標得分的乘積為 0～4分表示陰性結(jié)果，5～12分表示陽性結(jié)果。

1.3.2 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 將SUM159細胞復蘇后，添加含10%胎牛血清和1%青—鏈霉素雙抗的Ham’s F-12K培養(yǎng)液，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞生長至80%～90%時，用0.25%胰蛋白酶消化，傳代繼續(xù)培養(yǎng)。將細胞隨機分為Control組、shRNA-NC組、shRNA-ID-1組、pcDNA3.1-NC組、pcDNA3.1-ID-1組，采用Lipofectamine 2000將shRNA-NC、shRNA-ID-1、pcDNA3.1-NC和pcDNA3.1-ID-1質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至對應組的SUM159細胞中，按照試劑盒說明書操作，轉(zhuǎn)染48 h后，收集各組細胞和培養(yǎng)上清液，進行后續(xù)實驗，Control組細胞正常培養(yǎng)，不進行轉(zhuǎn)染。

1.3.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR) 在各組SUM159細胞中加入Trizol試劑液，使細胞充分裂解，按試劑盒說明書步驟提取細胞總RNA，核酸測定儀測定RNA含量和純度。利用一步法qRT-PCR進行反轉(zhuǎn)錄實驗，按照SensiFast cDNA合成試劑盒說明書進行操作。以獲得的cDNA為模板，在qRT-PCR系統(tǒng)中進行擴增，檢測ID-1 mRNA相對表達量，按照SensiFastTMSYBR Hi-ROX試劑盒說明書進行操作，以β-actin作為內(nèi)參基因。擴增條件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 5 s、60 ℃10 s，共40個循環(huán)。引物序列：ID-1上游序列5’-ACGGCTGTTACTCACGCCTC-3’，下游序列5’-GCTGGAGAATCTCCACCTTGC-3’；β-actin上游序列5’-TGCGTGACATGAGAAG-3’，下游序列5’-GCTCGTAGCTTCTCCA-3’。以2-ΔΔCt計算ID-1 mRNA相對表達量。

1.3.4 平板集落形成實驗 將各組SUM159細胞制備成單細胞懸液，按照每皿500個細胞的密度接種于細胞培養(yǎng)皿中，輕輕晃動使細胞均勻分散，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，當出現(xiàn)肉眼可見的集落時，終止培養(yǎng)，甲醇室溫固定，0.1%結(jié)晶紫染色，PBS清洗后，顯微鏡下計數(shù)各組的集落數(shù)目。

1.3.5 腫瘤球形成實驗 將各組SUM159細胞以1×104/孔的密度接種于低黏附細胞6孔板中，添加含有10 ng/mL bFGF、5 μg/mL胰島素、4 g/L BSA、1% B27及20 ng/mL EGF的培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1周，倒置顯微鏡下觀察腫瘤球體的形成與生長情況，并獲取圖像，計數(shù)球體個數(shù)。

1.3.6 HUVECs小管形成實驗 將Matrigel膠在4 ℃下過夜溶解，與緩沖液按照1∶1比例混合進行稀釋，取50 μL加入96孔板中，均勻鋪開，置于37 ℃下至基質(zhì)膠成固體狀。待HUVECs細胞消化后，收集轉(zhuǎn)染后各組細胞培養(yǎng)上清液與無血清細胞培養(yǎng)液按照1∶1比例混合，重懸HUVECs細胞，調(diào)整細胞密度，以1×104/孔的密度接種于鋪好Matrigel膠的96孔板內(nèi)，將培養(yǎng)板置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 h后，倒置顯微鏡下觀察各組成管效果并攝取圖像，采用Image J軟件進行分析。

1.3.7 免疫熒光染色法 將各組SUM159細胞以1×105/皿的密度接種于含爬片的培養(yǎng)皿，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，PBS清洗爬片，使用4%多聚甲醛室溫固定20 min，加入細胞通透劑0.1% Triton X-100處理5 min后，再以5% BSA封閉穿孔20 min，PBS清洗后，于玻片上滴加一抗工作液，4 ℃孵育過夜，次日棄去一抗工作液，并加入熒光二抗，避光條件下室溫染色2 h，PBS清洗，用DAPI在避光條件下孵育15 min，中性樹膠封片，通過倒置熒光顯微鏡觀察染色情況并攝取圖像。

1.3.8 Western blot 在各組SUM159細胞中添加含NP-40的PIPES緩沖液裂解細胞，獲得細胞總裂解物，BCA法檢測蛋白濃度。制備12% SDS-PAGE，取40 μg蛋白樣品上樣，通過電泳分離，將分離的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，TBST洗膜，再將膜浸泡在一抗工作液中4 ℃孵育過夜，次日TBST洗膜，將膜與對應二抗工作液共孵育2 h，TBST再次清洗后，使用BeyoECL顯色，以GAPDH作為內(nèi)參蛋白，采用Image J軟件分析各蛋白條帶灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度值比值作為目的蛋白相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌組織及癌旁組織中ID-1表達

免疫組織化學染色結(jié)果顯示，乳腺癌組織中ID-1陽性表達率為85.71%(36/42)，癌旁組織中ID-1陽性表達率為7.14%(3/42)，乳腺癌組織中ID-1陽性表達率顯著高于癌旁組織(P<0.05)，見圖1。

a：癌旁組織；b：乳腺癌組織圖1 乳腺癌組織及癌旁組織ID-1表達(免疫組織化學染色×100)

2.2 各組乳腺癌細胞ID-1表達比較

SUM159細胞轉(zhuǎn)染后，qRT-PCR和Western blot檢測結(jié)果顯示，與Control組和shRNA-NC組比較，shRNA-ID-1組ID-1 mRNA與蛋白表達水平均顯著下調(diào)(P<0.05)；與Control組和pcDNA3.1-NC組比較，pcDNA3.1-ID-1組ID-1 mRNA及蛋白表達水平均顯著上調(diào)(P<0.05)，見圖2。由此說明，成功得到抑制或過表達ID-1的SUM159細胞。

*：與Control組比較，P<0.05；#：與shRNA-NC組比較，P<0.05；△：與pcDNA3.1-NC組比較，P<0.05圖2 各組SUM159細胞ID-1 mRNA及蛋白表達比較

2.3 ID-1對乳腺癌細胞干細胞特性的影響

平板集落形成實驗結(jié)果顯示，與Control組和shRNA-NC組比較，shRNA-ID-1組SUM159細胞集落形成數(shù)目顯著減少(P<0.05)，SUM159細胞集落形成能力降低；與Control組和pcDNA3.1-NC組比較，pcDNA3.1-ID-1組SUM159細胞集落形成數(shù)目顯著增加(P<0.05)，說明SUM159細胞集落形成能力增強，見圖3。

*：與Control組比較，P<0.05；#：與shRNA-NC組比較，P<0.05；△：與pcDNA3.1-NC組比較，P<0.05圖3 各組SUM159細胞克隆形成比較

腫瘤球形成實驗結(jié)果顯示，與Control組和shRNA-NC組比較，shRNA-ID-1組形成的腫瘤球體體積明顯變小，球體數(shù)目顯著減少(P<0.05)；與Control組和pcDNA3.1-NC組比較，pcDNA3.1-ID-1組形成的腫瘤球體體積明顯增大，球體數(shù)目顯著增多(P<0.05)，見圖4。

*：與Control組比較，P<0.05；#：與shRNA-NC組比較，P<0.05；△：與pcDNA3.1-NC組比較，P<0.05圖4 各組SUM159細胞腫瘤球形成比較

2.4 ID-1對HUVECs小管生成的影響

HUVECs小管形成實驗結(jié)果顯示，與Control組和shRNA-NC組比較，shRNA-ID-1組HUVECs形成的分支點數(shù)減少(P<0.05)；與Control組和pcDNA3.1-NC組比較，pcDNA3.1-ID-1組HUVECs形成的分支點數(shù)顯著增加(P<0.05)，見圖5。

*：與Control組比較，P<0.05；#：與shRNA-NC組比較，P<0.05；△：pcDNA3.1-NC組比較，P<0.05圖5 各組HUVECs小管生成比較

2.5 ID-1對乳腺癌細胞中Src激酶活化的影響

免疫熒光染色檢測各組SUM159細胞中p-Src表達，以綠色熒光標記，結(jié)果如圖6所示，可見Control組、shRNA-NC組以及pcDNA3.1-NC組細胞中均有綠色熒光表達，而shRNA-ID-1組細胞中未見明顯的綠色熒光表達，同時，pcDNA3.1-ID-1組細胞中有較強的綠色熒光表達，說明過表達ID-1促進了Src激酶活化。

圖6 各組SUM159細胞內(nèi)p-Src表達(免疫熒光染色×100)

Western blot檢測結(jié)果顯示，與Control組和shRNA-NC組比較，shRNA-ID-1組SUM159細胞中p-Src蛋白表達水平顯著下調(diào)(P<0.05)；與Control組和pcDNA3.1-NC組比較，pcDNA3.1-ID-1組細胞中p-Src蛋白表達水平顯著上調(diào)(P<0.05)，見圖7。

1：Control組；2：shRNA-NC組；3：shRNA-ID-1組；4：pcDNA3.1-NC組；5：pcDNA3.1-ID-1組 *：與Control組比較，P<0.05；#：與shRNA-NC組比較，P<0.05；△：與pcDNA3.1-NC組比較，P<0.05圖7 各組SUM159細胞內(nèi)p-Src與Src蛋白表達比較

3 討論

目前，乳腺癌臨床治療中最關鍵的問題是缺乏敏感有效的分子靶點，大多數(shù)乳腺癌患者確診時已處于晚期，預后較差且病死率偏高[1]。乳腺癌病理過程較為復雜，涉及多種細胞活動以及相關信號通路的相互作用。因此，準確了解乳腺癌的發(fā)病分子機制將有助于發(fā)現(xiàn)有價值的生物標志物用于早期診斷或預測臨床結(jié)果。腫瘤干細胞(cancer stem cells，CSCs)是血液系統(tǒng)惡性腫瘤和實體瘤中存在的特定細胞亞群，首次在人類急性髓系白血病中被檢測到，CSCs具有較高的惡性程度，能夠促進腫瘤轉(zhuǎn)移與復發(fā)，并可使腫瘤細胞對治療藥物產(chǎn)生抵抗[9]。除了具備常見的腫瘤細胞能力(如遷移和侵襲)，CSCs還表現(xiàn)出特征性的干細胞特性，包括分化潛能多向、自我更新能力強和腫瘤起始細胞的作用。越來越多的證據(jù)表明，CSCs與胰腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌和乳腺癌等多種癌癥的發(fā)生和進展密切相關，可促進腫瘤細胞增殖以實現(xiàn)腫瘤異質(zhì)性，通過調(diào)節(jié)CSCs的分化和自我更新是治療乳腺癌的有效方式[10-12]。

ID-1在多個實體腫瘤中過表達，并且與腫瘤的高度侵襲性及患者的不良臨床結(jié)局密切相關，此外，ID-1還在胚胎神經(jīng)干細胞維持自我更新和多能性方面發(fā)揮重要作用[6,13]。Sun等[14]研究發(fā)現(xiàn)，ID-1通過激活Wnt/β-catenin、Shh以及ID-1-c-Myc-PLAC8信號通路來維持結(jié)直腸癌細胞的干細胞特性，并促進腫瘤細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。Li等[15]通過使用小干擾RNA敲低胃癌細胞中ID-1表達后發(fā)現(xiàn)，腫瘤干細胞關鍵相關因子Nanog和Oct-4的表達均受到抑制，并減弱了胃癌細胞中干細胞的自我更新能力，同時也降低了胃癌細胞增殖及對順鉑化療的抵抗。Cook等[16]的研究指出，ID-1在膠質(zhì)母細胞瘤中作為自我更新的腫瘤干細胞特性標記物，通過Cox-2衍生的PGE2激活ERK1/2-MAPK信號通路誘導ID-1表達，促進膠質(zhì)母細胞瘤細胞的自我更新與輻射抗性產(chǎn)生。本研究通過將shRNA-ID-1和pcDNA3.1-ID-1轉(zhuǎn)染至乳腺癌細胞系SUM159，并在基因和蛋白水平驗證抑制或過表達效率，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，在SUM159細胞中抑制ID-1表達后，細胞集落形成數(shù)目明顯減少，形成的腫瘤球體體積明顯變小且球體數(shù)目減少，說明抑制ID-1表達減弱了SUM159細胞的干細胞特性；而在過表達ID-1的SUM159細胞中，作用與抑制后完全相反，細胞集落形成數(shù)目和腫瘤球體數(shù)目顯著增加。由此推測，抑制ID-1表達可以降低乳腺癌細胞的干細胞特性。

腫瘤轉(zhuǎn)移是腫瘤患者治療失敗和死亡的主要原因。腫瘤血管生成是腫瘤進展的必要條件，其通過提供營養(yǎng)和氧氣，為腫瘤生長及轉(zhuǎn)移提供保障。血管生成是一個高度調(diào)節(jié)的過程，其中促血管生成因子和抗血管生成因子之間的相互作用介導了血管內(nèi)皮在血管生成不同階段的轉(zhuǎn)變，研究者們通過對腫瘤血管生成的不斷探究，很多靶向血管生成的藥物已投入臨床使用[17]。目前，在乳腺癌患者手術或放/化療的基礎上，輔以靶向血管生成的治療方法，可能對腫瘤轉(zhuǎn)移起到進一步的控制作用。已有研究表明，ID-1參與多條骨肉瘤血管生成相關通路，通過上調(diào)骨肉瘤細胞中VEGF-A的表達來促進骨肉瘤血管生成[18]；ID-1可以通過介導激活PI3K/Akt和NF-κB/MMP-2信號通路來增強卵巢癌內(nèi)皮祖細胞血管生成，因此ID-1及其下游效應子可作為治療卵巢癌的潛在靶點[19]；此外，在膠質(zhì)瘤中ID-1和VEGF的表達呈正相關，在腫瘤血管生成過程中起協(xié)同作用[20]。這些研究結(jié)果均提示ID-1可作為抗腫瘤血管生成的治療靶點。本研究中，采用抑制ID-1表達的乳腺癌細胞培養(yǎng)上清液處理HUVECs能夠減少小管生成，過表達ID-1的乳腺癌細胞培養(yǎng)上清液處理HUVECs則明顯促進了小管生成，與上述研究結(jié)果一致。

迄今為止，ID-1在腫瘤中發(fā)揮作用的潛在機制尚未充分闡明。Src激酶家族是一類非受體酪氨酸激酶，作為一種多效激活劑，可介導由G蛋白偶聯(lián)受體、β1-整聯(lián)蛋白、生長因子受體等啟動的眾多信號轉(zhuǎn)導通路，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著關鍵作用，參與調(diào)節(jié)各種腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等過程[21-22]。Src激酶活化后可與下游靶標因子相互作用，促進腫瘤進展。本研究通過檢測發(fā)現(xiàn)，抑制ID-1表達的SUM159細胞中未見明顯的p-Src標記綠色熒光表達，p-Src蛋白表達受到抑制，而過表達ID-1的細胞中有較強的綠色熒光表達，p-Src蛋白表達增加，由此說明，ID-1可能具有促進Src激酶活化的作用。

綜上，本研究通過檢測乳腺癌組織以及體外細胞發(fā)現(xiàn)，ID-1在乳腺癌組織中高表達，其能夠增加乳腺癌細胞干細胞特性，并且促進腫瘤血管生成，該作用機制可能與激活Src激酶途徑有關，由此推測ID-1有望成為乳腺癌治療的新靶點。但關于ID-1具體如何調(diào)控Src激酶表達以及該途徑是否涉及其他分子機制，有待后續(xù)進行更為深入的研究來闡明。