路曉月，王子夜，韓建瑋，許 露，張曉飛，韓 杰，王志剛，劉 越，索相敏，閻愛(ài)華

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，河北 保定 071000；2.河北省林木種質(zhì)資源和森林保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071000；3.河北省農(nóng)林科學(xué)院 石家莊果樹(shù)研究所，河北 石家莊 050061；4.河北省城市森林健康技術(shù)創(chuàng)新中心，河北 保定 071000)

蘋果再植病是一種全球性病害[1]，果樹(shù)患病后成活率降低，枝條生長(zhǎng)量變小，頂端生長(zhǎng)受阻，根系分生能力變差且易腐爛，結(jié)果能力下降甚至不結(jié)果，嚴(yán)重制約蘋果品種更新，威脅著產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)型升級(jí)[2-3]。

導(dǎo)致蘋果再植病發(fā)生的因素非常復(fù)雜，土壤結(jié)構(gòu)惡化、養(yǎng)分失調(diào)等非生物因素均會(huì)引發(fā)再植病[4]，但越來(lái)越多的研究表明，連作后土壤微生物群落多樣性失調(diào)，由高肥“細(xì)菌型”土壤轉(zhuǎn)化為低肥“真菌型”土壤是其發(fā)生的主要因素[5-6]，而且真菌、細(xì)菌、放線菌和植物病原線蟲(chóng)等病原物存在著復(fù)合侵染。梁魁景[7]對(duì)河北省200多個(gè)蘋果園再植病病因進(jìn)行了調(diào)查，發(fā)現(xiàn)鐮刀菌屬(Fusarium)和絲核菌屬(Rhizoctonia)、鏈格孢屬(Alternaria)和腐霉屬(Pythium)4種真菌均是引發(fā)河北省蘋果再植病的病原菌。再植病的發(fā)生不是單一病菌導(dǎo)致的，而是一種復(fù)雜的聯(lián)合侵染，同時(shí)受到多種真菌的影響。

木醋液是由農(nóng)林植物材料副產(chǎn)物高溫干餾冷卻液化得到的酸性液體，經(jīng)木醋液噴施處理可顯著提升植株的株高和地徑[8]；將其施入土壤可以改善土壤結(jié)構(gòu)，提高土壤肥力，增加有機(jī)氮含量，增強(qiáng)植株抗性，提高產(chǎn)量[9]，同時(shí)對(duì)大腸桿菌(Escherichiacoli)和青霉菌(Pseudomonasaeruginosa)等有較強(qiáng)的抑制作用[10]。前期研究中發(fā)現(xiàn)，木醋液施用到土壤中可以緩解蘋果再植病的發(fā)病程度，并且有明顯的劑量效應(yīng)[11]，但是其作用機(jī)理尚不明確。

本研究以蘋果砧木八棱海棠(Malusmicromalus)為研究對(duì)象，研究木醋液對(duì)土壤主要養(yǎng)分含量、生物學(xué)活性和土壤根際微生物群落的影響，旨為防治蘋果再植病提供理論基礎(chǔ)，為防控再植病提供新資源和方法。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地位于河北省農(nóng)林科學(xué)院石家莊果樹(shù)研究所蘋果示范園，處于河北省中南部(東經(jīng)113°30′～115°20′，北緯37°27′～38°47′)，屬暖溫帶大陸性季風(fēng)氣候，四季分明，雨量集中于夏秋季節(jié)，年總降水量401.1～752.0 mm。寒暑溫度差異較大，年均氣溫14 ℃左右。無(wú)霜期為197 d左右，年總?cè)照諘r(shí)數(shù)1 916.4～2 571.2 h，春夏日照充足，秋冬日照較少，具備良好的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)條件。

1.2 試驗(yàn)材料

木醋液由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)林木病蟲(chóng)害無(wú)公害調(diào)控實(shí)驗(yàn)室利用核桃殼高溫干餾制備，主要包括有機(jī)酸類化合物(26.64%)、酚類物質(zhì)(25.80%)、醛類化合物(20.35%)、酮類化合物(11.31%)、含氮有機(jī)化合物(5.44%)和醇類物質(zhì)(5.02%)等。供試植株為長(zhǎng)勢(shì)一致的健康一年生八棱海棠實(shí)生苗，產(chǎn)于石家莊果樹(shù)研究所蘋果苗圃。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)地內(nèi)布設(shè)10個(gè)1.5 m×0.8 m×0.5 m(長(zhǎng)×寬×深)的小區(qū)，間隔1.5 m，木醋液處理和對(duì)照各5個(gè)小區(qū)，隨機(jī)排列。每小區(qū)栽植10株苗木，生長(zhǎng)勢(shì)和株高整齊一致。株行距為0.3 m×0.3 m。2019年4月定植幼苗，木醋液處理用稀釋100倍的核桃殼木醋液500 mL灌根，對(duì)照灌入等量無(wú)菌蒸餾水，統(tǒng)一進(jìn)行田間管理。

1.3.2 植株生長(zhǎng)量測(cè)定 用卷尺測(cè)定植株高度，用游標(biāo)卡尺測(cè)量植株地徑。每株苗木選取枝條中上部成熟葉片3～5片，測(cè)定葉片面積[12]。

1.3.3 土壤樣品采集與保存 于2019年7月在每個(gè)小區(qū)中隨機(jī)選取5株植株，每株分東、南、西、北4個(gè)方向采集樹(shù)冠下20～30 cm深的根際土壤，混合后放入自封袋中，作為1個(gè)重復(fù)，木醋液處理和對(duì)照各5個(gè)重復(fù)，標(biāo)為CK1和MC1，置于冰盒，帶回實(shí)驗(yàn)室于-80 ℃冰箱保存。10月重復(fù)上述操作，樣品標(biāo)記為CK2和MC2。

1.3.4 土壤生物學(xué)相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

1.3.4.1 土壤主要養(yǎng)分含量的測(cè)定 參照喬勝英[13]的方法進(jìn)行土壤養(yǎng)分含量測(cè)定，運(yùn)用重鉻酸鉀容量法測(cè)定土壤有機(jī)質(zhì)；半微量凱氏定氮法測(cè)定全氮；堿解-擴(kuò)散吸收法測(cè)定堿解氮；碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法測(cè)定有效磷；乙酸銨提取-火焰光度法測(cè)定速效鉀；運(yùn)用電位計(jì)法測(cè)定pH值。

1.3.4.2 土壤酶活性的測(cè)定 運(yùn)用3，5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定蔗糖酶活性；苯酚鈉-次氯酸鈉比色法測(cè)定土壤脲酶活性；磷酸苯二鈉比色法測(cè)定堿性磷酸酶活性；KMnO4滴定法測(cè)定過(guò)氧化氫酶活性[14]。

1.3.4.3 根際土壤微生物種類多樣性測(cè)定 利用試劑盒提取樣品總DNA(MN NucleoSpin 96 Soi)，根據(jù)保守區(qū)設(shè)計(jì)得到引物，在引物末端加上測(cè)序接頭，進(jìn)行PCR擴(kuò)增并對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行純化、定量和均一化形成測(cè)序文庫(kù)，建好的文庫(kù)先進(jìn)行文庫(kù)質(zhì)檢，質(zhì)檢合格的文庫(kù)用Illumina HiSeq 2500技術(shù)，針對(duì)真菌的ITS1-ITS2和細(xì)菌的16S V3+V4、16S V4+V5區(qū)域由北京百邁克公司進(jìn)行高通量測(cè)序。采用Mothurversionv 1.30和R語(yǔ)言進(jìn)行多樣性和相對(duì)豐度分析，基于Python繪制物種相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖[15]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理統(tǒng)計(jì)，用SPSS 26.0進(jìn)行主成分分析，用Duncan檢驗(yàn)法進(jìn)行差異顯著性分析，利用SigmaPlot作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 木醋液對(duì)苗木生長(zhǎng)量的影響

與對(duì)照相比，木醋液顯著促進(jìn)了植株苗木生長(zhǎng)(表1)，木醋液處理的苗木株高和地徑年增長(zhǎng)量分別是對(duì)照的1.60，2.18倍。對(duì)照的葉面積年增長(zhǎng)量為14.71 cm2，木醋液處理葉面積年增長(zhǎng)量為20.29 cm2，是對(duì)照的1.38倍。

表1 木醋液對(duì)苗木年生長(zhǎng)量的影響Tab.1 Effect of pyroligneous acids on the annual growth of seedlings

2.2 木醋液對(duì)土壤主要養(yǎng)分含量的影響

施用木醋液后，7，10月土壤養(yǎng)分含量變化如表2所示，經(jīng)木醋液處理后土壤主要養(yǎng)分含量均高于對(duì)照。7月木醋液處理有機(jī)質(zhì)、全氮、堿解氮、有效磷和速效鉀含量分別為CK1的1.31，1.38，1.20，1.60，1.65倍，且差異達(dá)顯著水平(P<0.05)。10月木醋液處理有機(jī)質(zhì)、全氮、堿解氮、有效磷和速效鉀含量分別為CK2的1.12，1.03，1.58，1.40，1.25倍，差異亦達(dá)顯著水平(P<0.05)。

表2 土壤主要養(yǎng)分含量變化Tab.2 Changes in the content of major soil nutrients

2.3 木醋液處理對(duì)土壤酶活性的影響

7，10月土壤酶活性如表3所示，相較于對(duì)照，木醋液處理土壤蔗糖酶、脲酶活性均顯著提高(P<0.05)，7月蔗糖酶、脲酶活性分別是對(duì)照的1.60，1.53倍，10月分別是對(duì)照的2.10，1.18倍。與對(duì)照相比，木醋液處理過(guò)氧化氫酶活性雖有所提高，但無(wú)顯著差異。7月，堿性磷酸酶活性是對(duì)照的1.59倍，而10月低于對(duì)照。

表3 不同季節(jié)土壤酶活性的變化Tab.3 Changes in soil enzyme activity in different seasons

2.4 不同季節(jié)根際微生物多樣性分析

2.4.1 根際細(xì)菌和真菌Alpha多樣性分析 木醋液處理與對(duì)照Coverage指數(shù)均在0.99以上，7，10月根際細(xì)菌和真菌Alpha多樣性變化如表4所示，MC1和MC2木醋液處理土壤樣品中細(xì)菌和真菌的ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)均高于對(duì)照。其中10月木醋液處理后細(xì)菌和真菌ACE、Chao1、Shannon指數(shù)為最高。

表4 不同季節(jié)根際細(xì)菌和真菌Alpha多樣性分析Tab.4 Alpha diversity of bacteria and fungi in different seasons

2.4.2 根際細(xì)菌和真菌Beta多樣性分析 細(xì)菌組間主成分分析(PCA)結(jié)果如圖1所示，主成分1(PC1)和主成分2(PC2)貢獻(xiàn)率分別為83.62%，9.70%。7，10月木醋液處理與對(duì)照之間的相似性較低，菌群間的多樣性差異較大。

圖1 不同季節(jié)細(xì)菌PCA分析Fig.1 PCA analysis of bacteria in different seasons

真菌組間PCA分析結(jié)果見(jiàn)圖2，木醋液處理與對(duì)照相比真菌群落有明顯差別，主成分2(PC2)和主成分3(PC3)貢獻(xiàn)率分別為33.33%，3.66%，7，10月木醋液處理與對(duì)照之間的相似性較低且不在同一向限，菌群多樣性差異較大。

圖2 不同季節(jié)真菌PCA分析Fig.2 PCA analysis of fungi in different seasons

2.4.3 不同季節(jié)根際微生物優(yōu)勢(shì)群落分析

2.4.3.1 不同季節(jié)根際細(xì)菌優(yōu)勢(shì)群落分析 在門水平上對(duì)細(xì)菌各處理的相對(duì)豐度進(jìn)行分析，結(jié)果如圖3所示，根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化相對(duì)較小，CK1、MC1、CK2、MC2相對(duì)豐度前5的細(xì)菌優(yōu)勢(shì)門為變形菌門(Proteobacteria)(33.85%，34.96%，34.88%，31.49%)、酸桿菌門(Acidsobacteria)(22.05%，21.89%，22.59%，22.96%)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)(10.59%，9.97%，9.56%，9.85%)、綠彎菌門(Chloroflexi)(9.52%，9.47%，9.05%，8.75%)和棒狀桿菌門(Rokubacteria)(5.98%，6.28%，5.14%，5.11%)。7月，與CK1相比，木醋液處理顯著增加了變形菌門和棒狀桿菌門的相對(duì)豐度，分別增加了1.11，0.30百分點(diǎn)；降低了酸桿菌門、芽單胞菌門和綠彎菌門的相對(duì)豐度，分別降低了0.16，0.62，0.05百分點(diǎn)。10月，與CK2相比，木醋液處理增加了酸桿菌門和芽單胞菌門的相對(duì)豐度，分別增加了0.37，0.29百分點(diǎn)；降低了變形菌門、綠彎菌門和棒狀桿菌門的相對(duì)豐度，分別降低了3.39，0.30，0.03百分點(diǎn)。

圖3 不同季節(jié)細(xì)菌門水平物種相對(duì)豐度Fig.3 Relative abundance of species at the bacteria phylum level in different seasons

在屬水平根際細(xì)菌相對(duì)豐度如圖4所示，CK1、MC1、CK2、MC2相對(duì)豐度前5的細(xì)菌優(yōu)勢(shì)屬為uncultured_bacterium_c_Subgroup_6(7.33%，7.73%，7.52%，7.79%)、uncultured_bacterium_f_Gemmatimonadaceae(7.73%，7.37%，6.74%，6.63%)、uncultured_bacterium_o_Rokubacteriales(6.16%，5.98%，4.98%，5.14%)、RB41(4.19%，5.50%，5.43%，4.74%)和MND1(3.74%，4.46%，3.47%，3.10%)。7月，與CK1相比，木醋液處理增加了土壤中uncultured_bacterium_c_Subgroup_6、RB41和MND1的相對(duì)豐度，分別增加0.40，1.31，0.72百分點(diǎn)。降低了uncultured_bacterium_f_Gemmatimonadaceae和uncultured_bacterium_o_Rokubacteriales的相對(duì)豐度，分別降低了0.36，0.18百分點(diǎn)。10月，與CK2相比，木醋液處理增加了uncultured_bacterium_c_Subgroup_6和uncultured_bacterium_o_Rokubacteriales的相對(duì)豐度，分別增加了0.27，0.16百分點(diǎn)；降低了uncultured_bacterium_f_Gemmatimonadaceae、RB41和MND1的相對(duì)豐度，分別降低了0.11，0.69，0.37百分點(diǎn)。其中注釋到的細(xì)菌還有硝化螺旋菌屬(Nitrospira)和鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)。7月相對(duì)豐度分別增加了22.83，11.25百分點(diǎn)；10月硝化螺旋菌屬增加了17.17百分點(diǎn)，鞘氨醇單胞菌屬降低了3.56百分點(diǎn)。

圖4 不同季節(jié)細(xì)菌屬水平物種相對(duì)豐度Fig.4 Relative abundance of species at the bacteria genus level in different seasons

2.4.3.2 不同季節(jié)根際真菌優(yōu)勢(shì)群落分析 在門水平上對(duì)真菌各處理的相對(duì)豐度進(jìn)行分析，結(jié)果如圖5所示，土壤真菌群落鑒定為9門，CK1、MC1、CK2、MC2相對(duì)豐度前5的真菌優(yōu)勢(shì)門為子囊菌門(Ascomycota)(42.85%，37.25%，61.16%，66.14%)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)(13.32%，7.00%，11.99%，11.40%)、被孢霉門(Mortierellomycota)(6.67%，3.83%，6.03%，7.04%)、壺菌門(Chytridiomycota)(0.23%，0.21%，2.37%，1.05%)和球囊菌門(Glomeromycota)(0.23%，0.09%，0.28%，0.23%)。未得到分類學(xué)注釋的真菌(Unclassified)(29.06%，47.17%，14.67%，11.03%)占有很大比例。7月，與CK1相比，木醋液處理降低了子囊菌門、擔(dān)子菌門、被孢霉門、壺菌門和球囊菌門的相對(duì)豐度，分別降低了5.60，6.32，2.84，0.02，0.14百分點(diǎn)。10月，與CK2相比，木醋液處理增加了子囊菌門和被孢霉門的相對(duì)豐度，分別增加了4.98，1.01百分點(diǎn)；降低了擔(dān)子菌門、壺菌門和球囊菌門的相對(duì)豐度，分別降低了0.59，1.32，0.05百分點(diǎn)。

圖5 不同季節(jié)真菌門水平物種相對(duì)豐度Fig.5 Relative abundance of species at the fungi phylum level in different seasons

在屬水平根際真菌相對(duì)豐度分析如圖6所示，在屬水平上共檢測(cè)出9個(gè)真菌屬，CK1、MC1、CK2、MC2相對(duì)豐度前5的真菌優(yōu)勢(shì)屬為：枝孢屬(Cladosporium)(0.46%，0.56%，11.79%，14.41%)、被孢霉屬(Mortierella)(5.91%，3.08%，5.96%，6.51%)、土赤殼屬(Ilyonectria)(12.23%，1.50%，1.96%，1.11%)、久浩酵母屬(Guehomyces)(3.55%，2.41%，4.69%，3.17%)和鐮刀菌屬(Fusarium)(2.04%，1.81%，2.49%，2.24%)。7月，與CK1相比，木醋液處理降低了被孢霉屬、土赤殼屬、久浩酵母屬和鐮刀菌屬的相對(duì)豐度，分別降低了2.83，10.73，1.14，0.23百分點(diǎn)；增加了枝孢屬的相對(duì)豐度，增加了0.10百分點(diǎn)。10月，與CK2相比，木醋液處理降低了土赤殼屬、久浩酵母屬和鐮刀菌屬的相對(duì)豐度，分別降低了0.85，1.52，0.25百分點(diǎn)；提高了枝孢霉和被孢霉屬的相對(duì)豐度，分別增加了2.62，0.55百分點(diǎn)。

圖6 不同季節(jié)真菌屬水平物種相對(duì)豐度Fig.6 Relative abundance of species at the fungi genus level in different seasons

2.4.4 不同季節(jié)根際微生物相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)分析 正相關(guān)表示菌株之間存在共同的環(huán)境偏好或潛在的相互作用，負(fù)相關(guān)表示二者之間存在對(duì)抗作用。7，10月細(xì)菌相關(guān)性分析如圖7所示，種群豐富度最高的細(xì)菌分別為RB41、未確定到屬的芽單胞菌科(Gemmatimonadaceae)和未確定到屬的羅庫(kù)菌目(Rokubacteriales)。RB41與uncultured_bacterium_f_TRA3-20呈負(fù)相關(guān)。未確定到屬的芽單胞菌科與uncultured_bacterium_c_P2-11E呈負(fù)相關(guān)。未確定到屬的羅庫(kù)菌目與假苯基桿菌(Phenylobacterium)存在協(xié)同關(guān)系。7，10月真菌相關(guān)性如圖8所示，屬水平相關(guān)性最高的前50個(gè)真菌種類之中，種群豐富度最高的三類真菌分別為被孢霉屬、土赤殼屬和久浩酵母屬。被孢霉屬與絲殼屬(Kernia)呈正相關(guān)，與Knufia和莫氏黑粉菌屬(Moesziomyces)呈負(fù)相關(guān)。土赤殼屬與絲孢菌屬(Scedosporium)呈負(fù)相關(guān)。鐮刀菌屬與Lectera之間存在拮抗作用。

1.AKYG587;2.溶菌;3.Reyranella;4.SM1A02;5.uncultured_bacterium_o_NB1-j;6.紅游動(dòng)菌屬;7.uncultured_bacterium_c_KD4-96;8.Gaiella;9.假苯基桿菌;10.uncultured_bacterium_o_SBR1031;11.uncultured_bacterium_f_Rhodanobacteraceae;12.未分類到屬的脫硫盒菌科;13.Candidatus_Solibacter;14.未分類到屬的蓋勒氏菌目;15.uncultured_bacterium_c_P2-11E;16.Hirschia;17.uncultured_bacterium_c_Subgroup_25;18.uncultured_bacterium_f_Microscillaceae;19.未分類到屬的變形菌綱;20.uncultured_bacterium_c_JG30-KF-CM66;21.鞘氨醇單胞菌屬;22.Arenimonas;23.uncultured_bacterium_f_KF-JG30-B3;24.馬賽菌;25.未分類到屬的噬幾丁質(zhì)菌科;26.Gemmatirosa;27.未分類到屬的芽單胞菌屬;28.uncultured_bacterium_o_S085;29.硝化螺旋菌屬;30.節(jié)桿菌屬;31.uncultured_bacterium_c_AKAU4049;32.RB41;33.uncultured_bacterium_o_Subgroup_2;34.uncultured_bacterium_f_TRA3-20;35.uncultured_bacterium_f_A4b;36.Pseudolabrys;37.uncultured_bacterium_f_SC-I-84;38.酸桿菌屬;39.未分類到屬的裝甲菌門;40.未分類到屬的厭氧繩菌科;41.IS-44;42.Bryobacter;43.uncultured_bacterium_c_S0134_terrestrial_group;44.uncultured_bacterium_c_OM190;45.uncultured_bacterium_o_Dadabacteriales;46.未分類到屬的羅庫(kù)菌目;47.Steroidobacter;48.未分類到屬的酸桿菌目;49.uncultured_bacterium_f_Solimonadaceae;50.PAUC26f;51.uncultured_bacterium_c_Subgroup_15.

1.土赤殼屬; 2.漢納酵母屬; 3.鐮刀菌屬; 4.Calcarisporiella;5.Hydnophlebia;6.Mrakia;7.Lectera;8.莫氏黑粉菌屬;9.Vishniacozyma;10.Sphaerosporella;11.絲殼屬;12.Paurocotylis;13.阿德利長(zhǎng)西氏酵母;14.線黑粉酵母屬;15.桑帕約氏酵母;16.久浩酵母屬;17.Typhula;18.毛殼菌屬;19.赭霉屬;20.紅酵母屬;21.異莖點(diǎn)霉屬;22.平臍蠕孢屬;23.伽穆孢屬;24.周刺座霉屬;25.乳突赤殼屬;26.帚枝霉;27.黃曲霉;28.Papiliotrema;29.Rhizophagus;30.Knufia;31.鬼傘屬;32.蟲(chóng)草菌屬;33.絲孢菌屬;34.柄孢殼屬;35.鏈格孢屬;36.炭疽菌屬;37.油壺菌屬;38.粉紅粘帚霉;39.Powellomyces;40.Lophiostoma;41.小球腔菌屬;42.Plectosphaerella;43.裂褶菌;44.Latorua;45.梭孢殼屬;46.被孢霉;47.馬拉色霉菌屬;48.短柄霉屬;49.Ramicandelaber;50.Stagonosporopsis;51.盤菌屬。

2.4.5 根際細(xì)菌和真菌群落組成與土壤生物活性的相關(guān)性分析 土壤細(xì)菌門水平群落分布與土壤養(yǎng)分含量和土壤酶活性的冗余分析如圖9所示，第一、二排序軸的累計(jì)貢獻(xiàn)率為46.03%。變形菌門和擬桿菌門(Bacteroidetes)位于第一軸正端，與脲酶、全氮、有機(jī)質(zhì)、過(guò)氧化氫酶、堿性磷酸酶、pH值呈正相關(guān)，酸桿菌門與全氮、有機(jī)質(zhì)、過(guò)氧化氫酶、堿性磷酸酶、pH值呈正相關(guān)；而硝化螺旋菌門(Nitrospirae)、棒狀桿菌門、芽單胞菌門、綠彎菌門、黏膠球形菌門(Latescibacteria)和浮霉菌門(Planctomycetes)位于第一軸負(fù)軸，與土壤主要養(yǎng)分和酶活性的相關(guān)關(guān)系與酸桿菌門相反。從圖10可看出，土壤細(xì)菌屬水平群落分布與土壤養(yǎng)分含量和土壤酶活性的RDA分析表明，第一、二排序軸的累計(jì)貢獻(xiàn)率為38.41%。RB41、Ellin6055和鞘氨醇單胞菌屬位于第一軸正端，與土壤微生物全氮、速效鉀、有效磷、堿性磷酸酶、有機(jī)質(zhì)、脲酶、pH值呈正相關(guān)，Bryobacter和Subgroup_10與全氮、有機(jī)質(zhì)、pH值、過(guò)氧化氫酶呈正相關(guān)；Gaiella、mle1-7、赭黃嗜鹽囊菌(Haliangium)、硝化螺旋菌和MND1位于第一軸負(fù)端，與土壤養(yǎng)分和酶活性的相關(guān)關(guān)系與鞘氨醇單胞菌屬相反。

圖9 細(xì)菌門水平RDA分析Fig.9 Bacteria phylum level RDA analysis

圖10 細(xì)菌屬水平RDA分析Fig.10 Bacteria genus level RDA analysis

土壤真菌門水平群落分布與土壤養(yǎng)分含量和土壤酶活性的冗余分析表明(圖11)，第一、二排序軸的累計(jì)貢獻(xiàn)率為53.12%。表明土壤養(yǎng)分含量和酶活性對(duì)真菌群落結(jié)構(gòu)有較大的影響。梳霉門(Kickxellomycota)與堿解氮、蔗糖酶、有效磷、速效鉀呈正相關(guān)；Aphelidiomycota和Calcarisporiellomycota與堿解氮、pH值呈正相關(guān)。而子囊菌門、擔(dān)子菌門、壺菌門和油壺菌門(Olpidiomycota)則位于第一軸負(fù)端，與土壤養(yǎng)分和酶活性的相關(guān)關(guān)系與梳霉門相反。土壤真菌屬水平群落分布與土壤養(yǎng)分含量和土壤酶活性的冗余分析表明(圖12)，第一、二排序軸共可以解釋土壤真菌群落組成空間變化的35.40%。鏈格孢屬、枝孢屬、Lectera和露濕擬漆斑菌(Paramyrothecium)位于第一軸正端，與土壤微生物全氮、有機(jī)質(zhì)、脲酶、過(guò)氧化氫酶、pH值呈正相關(guān)；鐮刀菌屬和久浩酵母屬與土壤微生物全氮、有機(jī)質(zhì)、脲酶、過(guò)氧化氫酶、有效磷、速效鉀、堿性磷酸酶、pH值呈正相關(guān)。Solicoccozyma、乳突赤殼屬(Thelonectria)、土赤殼屬和被孢霉屬位于第一軸負(fù)端，Solicoccozyma與堿解氮、蔗糖酶呈正相關(guān)；乳突赤殼屬和土赤殼屬與堿解氮、蔗糖酶、堿性磷酸酶、有效磷、速效鉀呈正相關(guān)；被孢霉屬與過(guò)氧化氫酶和pH值呈正相關(guān)。

圖11 真菌門水平RDA分析Fig.11 Fungi phylum level RDA analysis

圖12 真菌屬水平RDA分析Fig.12 Fungi genus level RDA analysis

3 結(jié)論與討論

木醋液中含有大量的有機(jī)成分，能提高土壤有機(jī)質(zhì)、全氮、堿解氮和有效磷等主要養(yǎng)分含量。同時(shí)，還含有有機(jī)化合物和活性分子，可改善因連年種植破壞的土壤結(jié)構(gòu)，促進(jìn)土壤團(tuán)粒間的離子遷移，釋放原本被固定的土壤養(yǎng)分[16-17]。周紅娟等[18]將木醋液灌施到鹽堿土中，提高了土壤有機(jī)質(zhì)、全氮和速效磷等養(yǎng)分含量。而本研究中稀釋100倍的木醋液灌根處理后，蘋果再植病土壤主要養(yǎng)分含量均顯著增加。

此外，已有研究發(fā)現(xiàn)，木醋液富含有機(jī)小分子物質(zhì)，施用到土壤之中可以顯著提升土壤有效碳源的含量，為微生物繁殖營(yíng)造良好的營(yíng)養(yǎng)條件，不僅可以促進(jìn)微生物的繁殖還能提升微生物的活性，使其分泌出更多的酶，從而表現(xiàn)為土壤酶活性增大[19]。除此之外，木醋液所含有的部分有機(jī)物可直接作為底物，使微生物合成的酶含量增加，也表現(xiàn)為土壤酶活性的提升。程虎等[20]在小麥試驗(yàn)田中施入木醋液顯著提升了土壤酶活性，并且效果可持續(xù)60 d以上。本研究發(fā)現(xiàn)，添加木醋液后，土壤蔗糖酶、脲酶和過(guò)氧化氫酶活性均有不同程度的增加，直到秋季，木醋液處理的根際微生物多樣性仍然顯著高于對(duì)照，表明木醋液有較好的持效性。

木醋液通過(guò)影響土壤微生物種群的多樣性和有益菌的豐度，調(diào)節(jié)土壤中細(xì)菌和真菌的微生態(tài)環(huán)境，最終改良再植病土壤。曾婕等[21]研究木醋液對(duì)植煙土壤微生物多樣性的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，灌施木醋液顯著提升了土壤中細(xì)菌和真菌的多樣性。本研究表明，100倍木醋液灌根處理后提高了根際微生物群落Alpha多樣性和Beta多樣性。木醋液由多種有機(jī)物混合而成，其中部分有機(jī)物是土壤微生物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的，可直接被其吸收利用，促進(jìn)微生物的發(fā)育繁殖。一些有機(jī)物經(jīng)過(guò)分解以后能夠被微生物利用，從而增加微生物的數(shù)量，提高微生物活性。與此同時(shí)，還有一些有機(jī)物，例如鄰苯二酚、4-甲基茶兒酚等已證明具有明顯的抑菌作用，可減少微生物的數(shù)量或者抑制微生物的活性[3]。由此可知，施用木醋液可優(yōu)化土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，促進(jìn)土壤有益細(xì)菌的繁殖，抑制再植病的致病真菌，與王曉等[22]研究生物醋液對(duì)植煙土壤微生物改良結(jié)果一致。本研究中隨著季節(jié)的變化，土壤微生物的群落組成、含量和活性均會(huì)發(fā)生變化。100倍木醋液灌根處理后，7，10月根際土壤中硝化螺旋菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、RB41和MND1等有益細(xì)菌屬相對(duì)豐度顯著增加；鐮刀菌屬、土赤殼屬和鏈格孢菌屬等致病真菌相對(duì)豐度顯著下降。對(duì)于根際細(xì)菌來(lái)說(shuō)，硝化螺旋菌具有參與土壤硝化作用，與氮元素的轉(zhuǎn)化和生物有效性緊密相關(guān)[23]。鞘氨醇單胞菌屬具有較強(qiáng)的解磷、解鉀和固氮的能力，顯著地提升了土壤中的過(guò)氧化氫酶、脲酶和磷酸酶活性[24]，而RB41和MND1屬作為土壤的優(yōu)勢(shì)菌屬均有報(bào)道，李倩等[25]對(duì)黃花蒿連作土壤的研究中檢測(cè)出RB41、MND1為其連作土壤的優(yōu)勢(shì)菌屬。李強(qiáng)[26]研究表明，RB41是決定巖溶斷陷盆地土壤細(xì)菌-真核生物系統(tǒng)的關(guān)鍵類群。鄒慶甲等[27]研究證明，鐮刀菌屬和鏈格孢菌是河北省蘋果再植病害的主要疑似病原菌。伍曉麗等[28]發(fā)現(xiàn)，土赤殼屬是黃連根腐病的致病真菌。本研究中對(duì)于已報(bào)道的根際致病真菌鐮刀菌屬、土赤殼屬和鏈格孢菌屬在夏季和秋季均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，其中鐮刀菌屬與其他種群相關(guān)性較弱，且呈負(fù)相關(guān)。

RDA分析可以看出，真菌和細(xì)菌群落無(wú)論在門水平還是屬水平均與土壤全氮、有機(jī)質(zhì)、脲酶和蔗糖酶密切相關(guān)。在細(xì)菌屬水平上，有益細(xì)菌RB41、MND1、硝化螺旋菌屬和鞘氨醇單胞菌屬與土壤微生物全氮、速效鉀、有效磷、堿性磷酸酶、有機(jī)質(zhì)、脲酶和pH值呈正相關(guān)。真菌屬水平上，主要致病菌鐮刀菌屬和鏈格孢屬等與全氮、有機(jī)質(zhì)、脲酶、過(guò)氧化氫酶以及pH值呈現(xiàn)正相關(guān)。本研究中根際細(xì)菌和真菌都與pH值呈正相關(guān)，與李青梅等[29]研究獼猴桃園土壤結(jié)構(gòu)結(jié)果一致。另外，本研究中變化菌屬與全氮、有機(jī)質(zhì)、脲酶等密切相關(guān)，這可能是由于脲酶是土壤碳氮循環(huán)轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶，可通過(guò)調(diào)控碳、氮元素在土壤生態(tài)系統(tǒng)的流動(dòng)與循環(huán)，來(lái)影響土壤根際微生物群落結(jié)構(gòu)[30]。而有機(jī)質(zhì)和全氮是衡量土壤肥力的重要指標(biāo)，施用木醋液提高土壤微生物生物量和氮的含量，并減少氮的損失。

木醋液灌根可提高蘋果再植土壤養(yǎng)分和酶活，增加土壤微生物多樣性，改善土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，有利于促進(jìn)植株生長(zhǎng)，增強(qiáng)植株抗性，減輕再植病的危害。