吉 穎,孫 楓,吳淑華,李 碩,涂麗琴,高丹娜,崔曉艷,陳 新,季英華,郭青云
(1.青海大學(xué) 農(nóng)林科學(xué)院,青海省農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點實驗室,農(nóng)業(yè)部西寧作物有害生物科學(xué)觀測實驗站,青海 西寧 810016;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護研究所,江蘇 南京 210014;3.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 經(jīng)濟作物研究所,江蘇 南京 210014)
豇豆輕斑駁病毒(Cowpeamildmottlevirus,CpMMV)是一種重要的植物RNA病毒,隸屬于乙型線狀病毒科(Betaflexiviridae)香石竹潛隱病毒屬(Carlavirus)[1],病毒粒子為彎曲絲狀顆粒,大小約為650 nm×15 nm,基因組為單鏈正義RNA,全長8 194 bp,包含5′帽子和3′Poly(A)尾,共編碼6個蛋白:參與病毒基因組復(fù)制的依賴RNA的RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase,RdRp),參與病毒運動的三重基因塊1(Triple gene block 1,TGB1)、三重基因塊2(Triple gene block 2,TGB2)和三重基因塊3(Triple gene block 3,TGB3),外殼蛋白(Coatprotein,CP),核酸結(jié)合蛋白(Nucleic acid binding protein,NBP)[2]。
CpMMV主要由煙粉虱以非持續(xù)方式傳播[3],也能通過種子傳播[4],危害大豆、豇豆、菜豆等多種豆科作物。CpMMV最早于1973年在加納首次報道[5],隨后在非洲[6-10]、美洲[11-15]和亞洲[16-20]等多個熱帶和亞熱帶地區(qū)都出現(xiàn)該病危害。在我國,CpMMV最早于2013年在臺灣地區(qū)出現(xiàn)危害報道[19],之后在海南[20]和安徽[21]也出現(xiàn)危害報道,呈逐漸蔓延和加重的趨勢。目前,雖然CpMMV發(fā)生危害的報道較多,但明確全基因組序列信息的分離物還較少,我國目前僅海南[20]和安徽[21]2個分離物有基因組信息報道。
2019年在對江蘇省大豆病毒病進行調(diào)查時發(fā)現(xiàn),當(dāng)?shù)卮蠖股弦渤霈F(xiàn)了CpMMV的危害,為深入了解該分離物的特征及其分類地位,本研究利用分段法克隆其全基因組序列,解析基因組結(jié)構(gòu)特征,旨在明確分類地位,為后續(xù)進一步研究CpMMV的進化特征及致病機制奠定基礎(chǔ)。
1.1 試驗樣品
供試樣品為2019年采自徐州的大豆病樣,病樣葉片出現(xiàn)明顯黃化、花葉等癥狀。
1.2 總RNA提取
病樣總RNA的提取參照吳淑華等[22]的方法進行。取采集的大豆葉片放入液氮中處理后,轉(zhuǎn)移至全自動樣品研磨儀中研磨充分,加1 mL RNAiso Plus溶液,搖勻后靜置5 min;加400 μL RNA提取液,渦旋振蕩充分,室溫放置5 min后,4 ℃ 12 000 r/min離心 10 min;取上清液轉(zhuǎn)移至無菌離心管中,加入等量的冰異丙醇,輕輕混勻,-20 ℃放置30 min;4 ℃ 12 000 r/min離心10 min,后棄上清,用1 000 μL 75% 酒精清洗沉淀 2 次后,4 ℃ 8 000 r/min,離心5 min,棄上清,待酒精揮發(fā),加入30 μL的0.1% DEPC 水中,測定 RNA的濃度和質(zhì)量后,-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.3 cDNA合成
利用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄,反應(yīng)體系:Random 6 mers(10 μmol/L)1.0 μL,RNA 2.0 μL,ddH2O 5.0 μL,dNTP Mix(10 μmol/L)1.0 μL,Oligo dT Primer(50 μmol/L)1.0 μL;65 ℃反應(yīng)5 min,取出反應(yīng)液加入ddH2O 5.0 μL,RNase Inhibitor(40 U/μL)0.5 μL,5 × PrimeScript Buffer 4.0 μL,PrimeScriptRTase(200 U/μL)0.5 μL,于30 ℃ 10 min,42 ℃ 1 h,70 ℃ 15 min后結(jié)束,獲取的cDNA放于-20 ℃冰箱保存。
1.4 CpMMV基因組克隆
利用已公開的CpMMV基因組序列,合成4對特異性引物(表1),以上述的cDNA為模板進行PCR擴增,擴增體系:2 × PrimeSTARMax Premix 10 μL,上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL,cDNA 1.0 μL,ddH2O 8 μL,總體積20 μL;PCR程序:95 ℃預(yù)變性3 min;98 ℃10 s,53 ℃ 15 s,72 ℃2 min,30個循環(huán);72 ℃延伸5 min,4 ℃保存。取5 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后,使用回收試劑盒進行回收。將回收產(chǎn)物與pEAZY-Blunt Zero載體連接,熱激法轉(zhuǎn)化Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞,涂布均勻于氨芐(Amp+)培養(yǎng)基進行生長,PCR驗證單克隆菌落,驗證正確后將其送至通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司測序。
表1 引物信息Tab.1 Primers information
1.5 序列分析
測序完成后,依據(jù)片段的引物去掉兩端殘留的序列,拼接獲得基因組序列,將本研究的CpMMV基因組序列與已公布的CpMMV不同分離物及同屬其他病毒的基因組序列進行分析,序列同源性分析、多重比對利用ClustalX、BioEdit等軟件及NCBI網(wǎng)站上的Blast完成,聚類分析及進化樹構(gòu)建采用MEGA 6.0軟件的鄰接法完成[23]。
2.1 CpMMV基因組克隆策略
鑒于CpMMV基因組序列全長超過8 kb,因此擬采用分段克隆法:通過圖1中引物(4對),將CpMMV全長分為4段進行擴增和克隆。相鄰片段之間保留重疊部分序列,以保證序列能準(zhǔn)確拼接。
圖1 CpMMV基因組克隆策略Fig.1 The cloning strategy for CpMMV
2.2 CpMMV基因組克隆
基于制定的分段法克隆基因組序列策略,針對CpMMV基因組全長設(shè)計引物(表1)。以上述的cDNA為模板進行擴增,結(jié)果顯示,4對引物都擴到相對應(yīng)的特異性條帶(圖2)。將目的條帶進行回收,回收產(chǎn)物與pEAZY-Blunt Zero載體于25 ℃反應(yīng)40 min連接,熱激法轉(zhuǎn)化Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞后經(jīng)單菌落PCR篩選陽性克隆,陽性克隆鑒定后送至公司進行測序,最后經(jīng)序列拼接獲得CpMMV江蘇分離物的全基因組序列。
圖2 CpMMV基因組分段RT-PCR擴增Fig.2 RT-PCR amplification of CpMMV genome
2.3 CpMMV江蘇大豆分離物基因組結(jié)構(gòu)特征
CpMMV基因組序列經(jīng)信息分析后,結(jié)果顯示,其基因組全長為8 194 bp,共編碼6個蛋白(圖3),其中73~5 652 bp編碼由1 859個氨基酸組成分子質(zhì)量約為211.3 ku的復(fù)制酶蛋白(全長5 580 bp),5 681~6 376 bp編碼由231個氨基酸組成分子質(zhì)量約為25.6 ku的TGB1蛋白(696 bp),6 376~6 696 bp編碼由106個氨基酸組成分子質(zhì)量約為11.6 ku的TGB2蛋白(321 bp),6 674~6 880 bp編碼由68個氨基酸組成分子質(zhì)量約為7.7 ku的TGB3蛋白(207 bp),6 896~7 762 bp編碼由288個氨基酸組成分子質(zhì)量約為32 ku的外殼蛋白(867 bp),7 765~8 076 bp編碼由103個氨基酸組成分子質(zhì)量約為11.8 ku的NBP蛋白(312 bp);同時序列分析結(jié)果顯示,CpMMV江蘇分離物基因組兩端各有一個非編碼區(qū):5′端非編碼區(qū)長度為72 nt,3′端非編碼區(qū)長度為117 nt(圖3)。
圖3 江蘇侵染大豆的CpMMV基因組結(jié)構(gòu)Fig.3 Genome organization of CpMMV infecting soybean in Jiangsu Province
對CpMMV江蘇分離物編碼蛋白與其他分離物之間的同源性進行分析發(fā)現(xiàn),其與中國的2個分離物(MN908944、KY420906)同源性相對較高,而與其他分離物同源性相對較低;在6個編碼蛋白中,CP與其他分離物之間的同源性最高(96.5%~100.0%),暗示了CP蛋白可能相對保守,TGB2(84.0%~99.1%)和NBP(87.4%~98.1%)次之,RdRp(81.1%~98.2%)、TGB1(81.0%~97.0%)和TGB3(80.9%~95.6%)同源性相對較低,暗示了其在不同分離物之間可能表現(xiàn)較好的多樣性(表2)。
表2 CpMMV江蘇分離物編碼蛋白與其他分離物之間的同源性Tab.2 Amino acid sequence identities of CpMMV-Jiangsu with other CpMMV isolates %
2.4 CpMMV江蘇大豆分離物聚類分析
對獲得的CpMMV江蘇大豆分離物基因組序列進行比對分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),其與我國之前報道的分離物同源性相對較高:與安徽分離物(MN908944)的同源性最高(98.2%),與海南分離物(KY420906)同源性次之(96.0%),而與其他國外分離物之間的同源性相對較低(低于82.7%)(表3);系統(tǒng)進化分析結(jié)果也顯示,其他CpMMV分離物和本研究的CpMMV分離物都聚類到一個大分支上,其中安徽分離物、海南分離物共同聚類在一個小分支上,相對近緣,而與美國、巴西、印度、墨西哥、肯尼亞等其他國外分離物聚類到不同的分支,相對遠(yuǎn)緣(圖4)。
表3 序列分析涉及CpMMV與其他相關(guān)香石竹潛隱病毒屬成員的序列信息Tab.3 Sequence information of CpMMV and other member of Carlavirus used in the phylogenetic analysis
■.本試驗測定的CpMMV分離物。■.Isolate of CpMMV sequenced in this study.
豇豆輕斑駁病毒是我國近年來新發(fā)生的一種植物病毒,主要侵染豆科等多種作物,導(dǎo)致作物出現(xiàn)葉片輕斑駁褪綠等癥狀,嚴(yán)重時會產(chǎn)生畸形、甚至壞死癥狀[24],造成豆科等作物減產(chǎn)10%~15%,而其他病毒與CpMMV共侵染會帶來更嚴(yán)重的危害損失[1,11]。因此,應(yīng)加強CpMMV在生產(chǎn)上的監(jiān)測,預(yù)防其對我國作物安全生產(chǎn)造成進一步危害。
雖然世界各地已有多個CpMMV基因組相關(guān)報道[2,13],但目前在我國僅有海南[20]和安徽[21]2個分離物有基因組報道。本研究采用分段法克隆并獲得了江蘇CpMMV大豆分離物的基因組序列,明確了其基因組結(jié)構(gòu)特征,同時通過聚類分析發(fā)現(xiàn),其與我國其他2個分離物相對近緣,其中與安徽分離物同源性最高,這是江蘇省第1個CpMMV基因組序列相關(guān)報道。這些結(jié)果將有助于豐富CpMMV分子變異和群體遺傳學(xué)研究,為后續(xù)深入解析該病毒的流行及演化規(guī)律提供支持,同時對進一步研究其成災(zāi)病理和有針對性地制定防控策略也有重要意義。
CpMMV雖然早在1973年就有發(fā)生危害報道[5],但在我國,直到2009年(臺灣地區(qū):菜豆、豇豆)才首次出現(xiàn)危害[19],隨后該病在江西(2013—2014年,四季豆)、海南(2016年,豇豆)[20]、安徽(2019年,大豆)[21]相繼出現(xiàn)危害,從該病毒在我國的發(fā)生危害時間,結(jié)合部分地區(qū)基因組分析結(jié)果(目前,我國有基因組報道僅有海南分離物和安徽分離物),可以推測我國發(fā)生的CpMMV極有可能是從國外傳入,最早在臺灣地區(qū)發(fā)生,之后擴散到江西、海南,近年來陸續(xù)向北擴散到安徽、江蘇等地。鑒于CpMMV是一種重要的粉虱傳病毒,在多個國家和地區(qū)都有發(fā)生危害報道,同時CpMMV在豇豆、大豆、花生等[5]多種作物上有種子攜帶病毒報道,存在種傳風(fēng)險[4],因此,隨著傳播介體的大發(fā)生、各地種苗調(diào)運的頻繁以及耕作模式的更迭,此類病毒的不斷擴展蔓延將會對豆類等作物的安全生產(chǎn)帶來新的威脅,而目前對該病毒的成災(zāi)機理、品種抗性、防控技術(shù)等研究還較少,因此,生產(chǎn)上要密切關(guān)注此類病害的發(fā)生動態(tài),加強對產(chǎn)地種苗的檢測,做好應(yīng)急防控技術(shù)研究和儲備,及早發(fā)現(xiàn),盡早防控,減少損失。