馬瀟瀟，郭春香，陳官芝

青島大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科，山東 青島 266000

皮膚惡性黑色素瘤為起源于外層胚葉神經(jīng)嵴黑色素細胞的一類體表惡性腫瘤，其發(fā)病例數(shù)約占所有腫瘤的3%，居皮膚惡性腫瘤的第3位[1]。此外，研究顯示，皮膚惡性黑色素瘤的發(fā)病主要與環(huán)境、遺傳性基因變異等因素有關(guān)，其中最為主要的外源性致病原因是皮膚暴露于紫外線照射中[2]。因皮膚惡性黑色素瘤在發(fā)病初期易發(fā)生轉(zhuǎn)移、侵襲，且治療難度較大，患者預(yù)后差、病死率高，因此探尋皮膚惡性黑色素瘤發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)機制，對改善患者預(yù)后具有重大意義[3]。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transduction and activator of transcription 3，STAT3）、垂體同源框1（pituitary homeobox l，PITX1）及膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因同源蛋白-1（glioma-associated oncogene homoglog-1，Gli-1）在腫瘤組織中呈異常表達，并與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有緊密關(guān)系。但目前關(guān)于STAT3、PITX1及Gli-l在皮膚惡性黑色素瘤中作用機制的研究較為少見?；诖?，本研究就STAT3、PITX1及Gli-l在皮膚惡性黑色素瘤中的表達及臨床意義進行探討分析，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2017年8月至2020年8月于青島大學(xué)附屬醫(yī)院治療的皮膚惡性黑色素瘤患者的病歷資料。納入標準：①經(jīng)病理檢查、CT檢查等證實，均符合皮膚惡性黑色素瘤診斷標準；②未接受相關(guān)治療；③臨床資料完整。排除標準：①合并其他惡性腫瘤、器官衰竭等；②合并精神疾?。虎鄞嬖谄渌つw疾病；④有免疫系統(tǒng)疾病或結(jié)締組織病變。根據(jù)納入、排除標準，共納入89例皮膚惡性黑色素瘤患者，其中男50例，女39例；年齡37～68歲，平均（56.37±4.56）歲；TNM分期：Ⅰ期24例，Ⅱ期28例，Ⅲ期20例，Ⅳ期17例。選取皮膚惡性黑色素瘤患者的腫瘤組織及癌旁組織（距腫瘤組織﹥3 cm）。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準通過，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 檢測方法

所有組織于手術(shù)切除后立即使用10%甲醛固定，切片后脫蠟、水化。采用免疫組化法進行檢測，將標本浸泡于3%過氧化氫中20 min，封閉其內(nèi)源性過氧化物酶活性。高壓枸櫞酸鹽抗原修復(fù)，溫水清洗后使用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗3次，每次3 min，同時在其中滴加正常羊血清以阻斷非特異性結(jié)合，放入37℃孵育箱30 min。滴加一抗兔抗人STAT3多克隆抗體（1∶200）、兔抗人PITX1多克隆抗體（1∶200）、兔抗人Gli-1多克隆抗體（1∶150），4℃過夜，PBS再次清洗，滴加生物素標記的STAT3、PITX1、Gli-1蛋白二抗，以37℃孵育0.5 h，于第3次PBS清洗后，滴加二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色劑，采用蘇木素復(fù)染，于脫水、干燥后使用中性樹脂封片，用PBS代替一抗作為陰性對照。

根據(jù)陽性細胞百分比及染色情況判定STAT3、PITX1、Gli-1的表達情況[4-6]。陽性細胞百分比：無陽性細胞為0分，1%～25%為1分，26%～50%為2分，﹥50%為3分。染色情況：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分?？偡譃樯鲜?項評分的乘積，≤3分為陰性表達，≥4分為陽性表達。

1.3 觀察指標

對比腫瘤組織與癌旁組織中STAT3、PITX1、Gli-1表達情況。經(jīng)回院復(fù)查、電話隨訪等方式了解皮膚惡性黑色素瘤患者的預(yù)后情況，隨訪1年，以發(fā)生復(fù)發(fā)或死亡作為預(yù)后不良的標準將其分為預(yù)后良好以及預(yù)后不良，比較預(yù)后良好及預(yù)后不良患者STAT3、PITX1、Gli-1蛋白表達情況，并對皮膚惡性黑色素瘤患者預(yù)后的影響因素進行分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)及率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；影響因素分析采用Logistic回歸分析；以P﹤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤組織與癌旁組織中STAT 3、PITX 1、Gli- 1表達情況的比較

腫瘤組織中STAT3、Gli-1蛋白陽性表達率均明顯高于癌旁組織，PITX1陽性表達率明顯低于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P﹤0.01）。（表1）

表1 腫瘤組織與癌旁組織中STAT 3、PITX 1、Gli- 1蛋白表達情況的比較[ n（%）]

2.2 預(yù)后良好與預(yù)后不良患者腫瘤組織中STAT 3、PITX 1、Gli- 1蛋白表達情況的比較

所有患者均成功完成隨訪，其中預(yù)后良好61例，預(yù)后不良28例。預(yù)后不良患者腫瘤組織中STAT3、Gli-1蛋白陽性表達率均高于預(yù)后良好患者，PITX1陽性表達率低于預(yù)后良好患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P﹤0.05）。（表2）

表2 預(yù)后良好與預(yù)后不良患者腫瘤組織中STAT 3、PITX 1、Gli- 1蛋白表達情況的比較[ n（%）]

2.3 皮膚惡性黑色素瘤患者預(yù)后影響因素的單因素及多因素分析

Logistic回歸分析顯示，腫瘤直徑≥5 cm、STAT3陽性、PITX1陰性、Gli-1陽性均為皮膚惡性黑色素瘤患者預(yù)后不良的獨立危險因素（P﹤0.05）。（表3）

表3 皮膚惡性黑色素瘤患者預(yù)后影響因素的單因素及多因素分析

3 討論

黑色素瘤是由于黑色素細胞異常增生所形成的，屬于惡性腫瘤，多發(fā)生于皮膚及黏膜組織，據(jù)不完全統(tǒng)計，90%左右的黑色素瘤為皮膚黑色素瘤[7-8]。隨著近些年來檢測水平的提升，對于皮膚惡性黑色素瘤的檢出率也逐年提高，但由于皮膚惡性黑色素瘤發(fā)病較為隱匿，致使患者對其不夠重視，從而導(dǎo)致多數(shù)患者在就診時病情已發(fā)展至中晚階段，嚴重影響治療效果[9]。因此，對皮膚惡性黑色素瘤的致病機制進行深入了解，探尋皮膚惡性黑色素瘤的分子標志物，為臨床治療提供新思路，對改善患者的預(yù)后具有重要意義。

STAT3為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子家族成員，在多種因子的細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著重要作用。STAT3一般存在于細胞質(zhì)中，在正常狀態(tài)下，STAT3僅會被短暫激活，持續(xù)時間僅為幾分鐘或者幾小時，而當機體出現(xiàn)腫瘤時，STAT3會處于持續(xù)激活的狀態(tài)，且會移位到細胞核中，并對目的基因的表達進行恒定調(diào)控，并促進腫瘤細胞的增殖、轉(zhuǎn)移[10]。目前較多研究已證實，STAT3在食管癌、胃癌、鼻咽癌等多種惡性腫瘤中異常表達，但較少見STAT3在皮膚惡性黑色素瘤中的研究報道[11]。本研究結(jié)果顯示，腫瘤組織中STAT3陽性表達率明顯高于癌旁組織，且預(yù)后不良患者STAT3陽性表達率高于預(yù)后良好患者，提示STAT3可能在皮膚惡性黑色素瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用。

PITXl屬于PITX轉(zhuǎn)錄因子家族成員，其與黑素細胞皮質(zhì)素原基因的表達存在一定的聯(lián)系，并參與人體四肢的發(fā)育過程[12]。研究指出，PITX1為一種特殊的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，其通過對細胞中端粒逆轉(zhuǎn)錄酶的轉(zhuǎn)錄激活發(fā)揮抑制作用，以影響細胞的增殖、分化，且PITXl還有著抑制致癌基因RAS轉(zhuǎn)錄活性的功能[13]。本研究中，腫瘤組織中的PITX1陽性表達率明顯低于癌旁組織，且預(yù)后不良患者PITX1陽性表達率低于預(yù)后良好患者，這說明PITXl可能對皮膚惡性黑色素瘤的發(fā)生、發(fā)展起負性調(diào)控作用。Gli-l屬于Gli蛋白家族成員，為刺猬因子通路下游的一種重要轉(zhuǎn)錄因子，已被證實在髓母細胞瘤、肝癌及胃癌中異常表達[14]。且研究表明，Gli-l蛋白不僅是刺猬因子通路下游的效應(yīng)點，且可能為癌變的致病機制信號通路的交叉點，可與其他信號通路的分子共同參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程[15]。本研究中，腫瘤組織中Gli-1陽性表達率明顯高于癌旁組織，且預(yù)后不良患者Gli-1陽性表達率高于預(yù)后良好患者，進一步證實了上述觀點，說明可將Gli-l蛋白作為觀察皮膚惡性黑色素瘤患者預(yù)后情況的指標。本研究對皮膚黑色素瘤患者預(yù)后影響因素進行分析，得出腫瘤直徑≥5 cm、STAT3陽性、PITX1陰性、Gli-1陽性均為皮膚惡性黑色素瘤患者預(yù)后不良的獨立危險因素。綜上所述，STAT3、PITX1及Glil蛋白在皮膚惡性黑色素瘤中存在異常表達，通過檢測其水平能為臨床預(yù)后及治療提供新的思路與依據(jù)。