周維利，孫銅，王坤

(山東省食品藥品檢驗研究院，山東 濟南 250101)

乳塊散結(jié)顆粒由丹參、川楝子、皂角刺、柴胡(醋制)、赤芍、醋香附、夏枯草、鱉甲(醋制)、橘葉、昆布、王不留行和淫羊藿組成，功能活血化瘀，疏肝理氣，軟堅散結(jié)。臨床上用于肝氣瘀滯，痰瘀互結(jié)所致的乳腺增生。本試驗以丹參素含量為指標(biāo)，對其提取和制備工藝進行了研究，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與材料

1.1 儀器 HS-337電子分析天平(邢臺慧思科技有限公司)；ESJ203-S電子分析天平(洛陽美優(yōu)實驗設(shè)備有限公司)；KQ3200DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；島津LC-20高效液相色譜儀(島津)；Shimpack VP-ODS(C18柱，4.6 mm×250 mm，5 μm)；LC-RE-5000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海力辰儀器科技有限公司)；101-1AB電熱恒溫干燥箱(金壇市水北科普實驗儀器廠)。提取設(shè)備、離心機。

1.2 試劑 丹參、川楝子、皂角刺、柴胡(醋制)等藥材飲片(濟南漱玉平民大藥房有限公司)、丹參素對照品(110855-201614，20 mg/支，標(biāo)示含量98.1%，中國食品藥品檢定研究院)；乳塊散結(jié)顆粒(自制)；陰性對樣品(自制)；乙腈、甲醇和冰醋酸為色譜純，水為重蒸去離子水，草酸為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 丹參素含量測定方法

2.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗[1-6]以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-甲醇-水-冰醋酸(0.5∶8∶92∶1)為流動相；檢測波長為280 nm。理論板數(shù)按丹參素峰計算不得低于3 500。

2.1.2 對照品溶液 取丹參素鈉對照品適量，精密稱定，加50%甲醇溶液制成每1 mL含50 μg的溶液(相當(dāng)于每1含丹參素45 μg)，即得[7]。

2.1.3 供試品溶液 ①取乳塊散結(jié)顆粒適量，研細，取約1.0 g，精密稱定，置離心管中，加水2 mL及中性氧化鋁(100～200目)1.5 g，攪拌均勻，用水洗滌3次，每次10 mL，離心(3 000 r·min-1)棄去水洗液，再用5%草酸溶液攪拌提取3次，每次8 mL，離心，合并5%草酸溶液，置25 mL量瓶中，加5%草酸溶液至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得[7]；②取工藝研究試驗得清膏2 mL，置離心管中，中性氧化鋁(100～200目)1.5 g，攪拌均勻，同①操作，即得。

2.1.4 陰性溶液 制備不含丹參的乳塊散結(jié)顆粒，按“2.1.3”項下操作，即得陰性樣品。

2.1.5 專屬性 分別取乳塊散結(jié)顆粒供試品、丹參素對照品以及陰性對照3種溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣、測定，不含丹參的陰性對照在丹參素峰處無干擾,見圖1～3。

圖1 丹參素對照品HPLC圖

圖2 乳塊散結(jié)顆粒HPLC圖

圖3 不含丹參陰性HPLC圖

2.1.6 線性與范圍 取丹參素鈉對照品適量，精密稱定，加5%草酸溶液溶解并稀釋至刻度，作為丹參素鈉對照品貯備液(相當(dāng)于含丹參素264.55 g·mL-1)；分別精密量取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 mL貯備液置25 mL量瓶中，用5%草酸溶液稀釋至刻度，搖勻，作為丹參素對照品溶液。分別吸取上述對照品溶液，按“2.1.1”項下條件進樣、測定，以濃度C和峰面積A計算，得回歸方程為A=78 937C+928.57，R2=0.999 3；丹參素在10.58～84.65 μg·mL-1范圍內(nèi)，峰面積與濃度呈良好線性關(guān)系。

2.1.7 精密度試驗 取丹參素對照品溶液(42.33 μg·mL-1)按“2.1.1”項下色譜條件進樣、測定，連續(xù)進樣6次，峰面積RSD為1.21%。

2.1.8 重復(fù)性試驗 取20200502批乳塊散結(jié)顆粒(1.02 mg·g-1)樣品6份，按“2.1.3”項下制備，按“2.1.1”項下色譜條件進樣、測定，重復(fù)測定6次，丹參素含量的RSD為0.996%。

2.1.9 穩(wěn)定性試驗 取20200502批乳塊散結(jié)顆粒供試品溶液分別于0、2、4、6、8和12 h進樣測定，丹參素峰面積RSD為0.867%，供試品溶液在室溫條件下在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.10 回收率試驗 取20200502批乳塊散結(jié)顆粒適量，研細，取約0.5 g，精密稱定，取6份，照“2.1.3”項下方法處理，并分別加入丹參素對照品溶液(52.91 μg·mL-1)10.0 mL，混勻，按“2.1.1”項下色譜條件進樣、測定，丹參素平均回收率為97.45%，RSD為1.56%。

2.2 工藝研究

2.2.1 提取工藝研究 通過預(yù)試驗及參考相關(guān)文獻，經(jīng)預(yù)試驗后以水為提取溶劑。分別稱取丹參200 g、川楝子40 g、皂角刺64 g、柴胡(醋制)48 g、赤芍56 g、醋香附40 g、夏枯草40 g、鱉甲(醋制)40 g、王不留行64 g、橘葉64 g、昆布64 g、淫羊藿80 g，共9份，每份計800 g，按表1進行試驗，以丹參素含量為評價指標(biāo)進行試驗，因素水平見表1～3。

表1 水提因素水平表

表2 L9(34)正交試驗設(shè)計與結(jié)果

表3 水提方差分析

由直觀分析可知，各因素影響依次為B>A>C，最佳為A3B3C2(藥材加8倍量水提取3次，每次3 h)；考慮到生產(chǎn)成本、效率和人工等因素，綜合考慮選擇A2B2C1(藥材加8倍量水提取2次，每次2 h)。

2.2.2 提取工藝驗證 稱取乳塊散結(jié)顆粒處方中各藥材飲片6份，每份800 g，分別按A3B3C1和A2B2C1各提取3次，濃縮為1.26(80 ℃)的清膏，測定丹參素含量，結(jié)果見表4。

表4 提取工藝驗證試驗結(jié)果表

按A3B3C1與A2B2C1工藝各提取3次，工藝A2B2C1與工藝A3B3C1相比，丹參素含量基本無差別，故選擇按A2B2C1進行提取。

2.2.3 醇沉工藝研究

2.2.3.1 醇沉濃度試驗 稱取乳塊散結(jié)顆粒處方中各藥材飲片4份，每份800 g，按A2B2C1提取，提取液濾過，濾液合并濃縮至1.27(80 ℃)的清膏，分成4份，以不同含醇量進行醇沉，攪勻，靜置48 h，濾取上清液，回收乙醇，濃縮為稠膏，測定丹參素含量與稠膏率，結(jié)果見表5。

表5 醇沉濃度試驗結(jié)果表

乙醇濃度為75%進行醇沉?xí)r丹參素含量與出稠膏均合適，故選擇醇沉濃度為75%。

2.2.3.2 靜置時間試驗 按“2.2.3.1”項下方法制備清膏，測定含量，分成4份，加乙醇進行醇沉，靜置不同時間，濾取上清液，回收乙醇，濃縮為稠膏，測定丹參素含量與稠膏率，結(jié)果見表6。

表6 醇沉后靜置時間試驗結(jié)果表

藥液靜置48 h，分層明顯，容易過濾，故選擇靜置時間為48 h。

2.2.4 成型工藝研究 取丹參200 g、川楝子40 g、皂角刺64 g、柴胡(醋制)48 g、赤芍56 g、醋香附40 g、夏枯草40 g、鱉甲(醋制)40 g、王不留行64 g、橘葉64 g、昆布64 g、淫羊藿80 g，每份計800 g，4份，按“2.2.3.1”項下方法制備清膏，使乙醇濃度達75%，醇沉，靜置，濾過，回收乙醇，濃縮為稠膏，分成4份，加入不賦形劑制軟材，以14目尼龍網(wǎng)篩制粒，75 ℃干燥，16目篩整粒。

表7 賦形劑試驗結(jié)果表

結(jié)果：在成型試驗中，以可溶性淀粉與糊精(1∶1)賦形劑時易制粒，顆粒成型率最佳。

3 討論

3.1 處方中藥材飲片的各主要藥理成分均溶于水，以水溶性成分丹參素含量為指標(biāo)，經(jīng)預(yù)試驗后以水為溶劑進行了正交優(yōu)選，對乳塊散結(jié)顆粒的最佳直觀工藝和綜合考慮后提取工藝各進行3批驗證試驗，最終選定提取工藝為藥材飲片加8倍量水提取2次，每次2 h。為最大可能保留有效成分，易于成型，減少顆粒裝量，便于患者服用，水提液濃縮至相對密度為1.25～1.30(80 ℃)時進行了醇沉，減少出膏量。

3.2 可溶性淀粉為白色細膩粉末，是可溶顆粒的良好稀釋劑，并有矯味及黏合作用；糊精為白色或微帶黃色的細膩粉末，不溶于醇，微溶于水，能溶于沸水成黏膠狀溶液，黏性強，并呈弱酸性[8]。在顆粒的成型試驗中，醇沉后上清液濃縮成稠膏，加入可溶性淀粉與糊精(1∶1)為賦形劑制粒，在賦形劑與稠膏比大于3時易于制粒，顆粒成型性好，簡化了清膏干燥、粉碎的工序，可節(jié)約資源與人工，提高生產(chǎn)效率。