王國(guó)英，周剛

內(nèi)蒙古自治區(qū)藥品檢驗(yàn)研究院，內(nèi)蒙古自治區(qū) 呼和浩特市 010020

曲安奈德新霉素貼膏是由醋酸曲安奈德、硫酸新霉素、麝香草酚、氧化鋅等加入天然橡膠等基質(zhì)制成的橡膠膏劑，上海衛(wèi)生材料廠首次研發(fā)，臨床主要用于局限性神經(jīng)性皮炎、慢性濕疹及小面積的銀屑?。?-3］，近年還發(fā)現(xiàn)它可有效地治療結(jié)節(jié)性癢疹［4］、結(jié)節(jié)性疥瘡［5］、蕁麻疹［6］等。本品中的醋酸曲安奈德是一種具有持久抗炎作用的長(zhǎng)效糖皮質(zhì)激素藥物［7］，多用于治療諸如彌漫性風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、結(jié)締組織疾病的治療［8］。

經(jīng)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局網(wǎng)查詢，該品種共有18個(gè)生產(chǎn)廠家、18 個(gè)批準(zhǔn)文號(hào)，4 種規(guī)格，分別為4 cm×6.5 cm、5 cm×6.5 cm、7 cm×10 cm、8 cm×13 cm。通過(guò)對(duì)現(xiàn)行國(guó)內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行查詢，《中國(guó)藥典》（Chinese Pharmacopoeia，ChP）、《英 國(guó) 藥 典》（British Pharmacopoeia，BP）、《歐洲藥典》（European Pharmacopoeia，EP）、《美 國(guó) 藥 典》（United States Pharmacopoeia，USP）及《日本藥局方》（Japanese British Pharmacopoeia，JP）僅收載了曲安奈德原料，均未收載曲安奈德新霉素貼膏。目前該品種收載于國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局（State Food and Drug Administration,SFDA）國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)化藥第十一冊(cè)［9］，原標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)項(xiàng)目設(shè)置簡(jiǎn)單，對(duì)兩種有效成分僅進(jìn)行鑒別實(shí)驗(yàn)，未對(duì)含量進(jìn)行控制。為完善藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本研究建立高效液相色譜內(nèi)標(biāo)法測(cè)定曲安奈德新霉素貼膏中醋酸曲安奈德含量，并進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證，結(jié)果表明該方法科學(xué)合理，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，可用于曲安奈德新霉素貼膏中醋酸曲安奈德的含量測(cè)定。

1 儀器與試藥

1.1 儀器與試劑

島津2010A型高效液相色譜儀；Millpore超純水機(jī)；Sarlorius AL204、Sarlorius MSA125P-1CE-DI、Sarlorius MAX（SG EA）電子天平；KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DHG-9145A 型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海-恒科學(xué)儀器有限公司）。

試劑：甲醇（色譜純），高純水（實(shí)驗(yàn)室自制），正辛烷、乙醇（分析純，國(guó)藥試劑），其他為分析純。

1.2 樣品

醋酸曲安奈德對(duì)照品（批號(hào)100125-201406，純度99.1%，來(lái)源：中國(guó)食品藥品檢定研究院）；炔諾酮對(duì)照品（批號(hào)100053-201807，純度99.4%，來(lái)源：中國(guó)食品藥品檢定研究院）；三家企業(yè)提供的3 批曲安奈德新霉素貼膏，分別為企業(yè)A 樣品（批號(hào)200203，規(guī)格4 cm×6.5 cm，），企業(yè)B 樣品（批號(hào)200317，規(guī)格4 cm×6.5 cm），企業(yè)C（批號(hào)191002，規(guī)格4 cm×6.5 cm）含醋酸曲安奈德均不得少于16 μg/cm2，本次試驗(yàn)及方法學(xué)考察所用樣品為企業(yè)A 樣品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：CAPCELL PAK C18 MG Ⅱ（4.6 mm×250 mm，5 μm）；檢測(cè)波長(zhǎng)240 nm；柱溫30 ℃；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量20 μL；以甲醇為流動(dòng)相A，水為流動(dòng)相B，按表1 進(jìn)行梯度洗脫。

表1 梯度洗脫程序

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

2.2.1 內(nèi)標(biāo)溶液的制備 取炔諾酮對(duì)照品適量，加甲醇溶解并稀釋制成每1 mL 中含0.20 mg 的溶液，作為內(nèi)標(biāo)溶液 。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 取醋酸曲安奈德對(duì)照品適量，精密稱定，置50 mL 量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，制成每1 mL 中含0.80 mg 的溶液，作為對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。分別精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備溶液與內(nèi)標(biāo)溶液各1 mL，置同一50 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取樣品20 片，除去蓋襯，取約2 片量（約52 cm2），剪成小塊（約0.25 cm2），精密稱定，置分液漏斗中，加50 mL 正辛烷，精密加內(nèi)標(biāo)溶液1 mL，振搖使膏體溶解，用90%乙醇分次萃?。?0、15、15、10 mL），合并下層溶液，水浴蒸干，將蒸干的殘?jiān)由倭恳宜嵋阴ト芙?，轉(zhuǎn)移至50 mL 量瓶中，再用甲醇分次溶解剩余殘?jiān)?，完全轉(zhuǎn)移至上述容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，作為供試品溶液。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 專屬性試驗(yàn) 按曲安奈德新霉素貼膏處方，除醋酸曲安奈德外，取2 片量的輔料，置50 mL 分液漏斗中，照“供試品溶液的制備”項(xiàng)下方法處理，制備陰性對(duì)照溶液，取空白溶劑及陰性對(duì)照溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件檢測(cè)，結(jié)果顯示，空白溶劑及輔料在醋酸曲安奈德及內(nèi)標(biāo)物質(zhì)出峰時(shí)間內(nèi)對(duì)測(cè)定不存在干擾，專屬性較好。見(jiàn)圖1。

圖1 專屬性試驗(yàn)液相色譜圖：A.空白溶劑；B.陰性對(duì)照溶液；C.對(duì)照品溶液；D.曲安奈德新霉素貼膏供試品溶液

2.3.2 線性關(guān)系考察 精密稱取醋酸曲安奈德對(duì)照品適量，加甲醇溶解并稀釋制成每1 mL 含醋酸曲安奈德0.40 mg 的溶液，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、5.0 mL，分別置50 mL 量瓶中，分別加入內(nèi)標(biāo)溶液1 mL，加甲醇稀釋至刻度，作為系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液。按照“2.1”項(xiàng)下的色譜條件檢測(cè)，以濃度為橫坐標(biāo)（X），A（對(duì)照品）/A（內(nèi)標(biāo)）為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：Y=6.635 4X+0.085 2（n=6，r=0.999 0）。結(jié)果表明醋酸曲安奈德在4 μg/mL～40 μg/mL 內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.3 精密度試驗(yàn) 精密量取同一批供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，測(cè)定得醋酸曲安奈德含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.9%，結(jié)果表明該實(shí)驗(yàn)方法精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 照“供試品溶液的制備”項(xiàng)下處理供試品1 份，分別于0、6、12、24、36、48 h 進(jìn)行了測(cè)定，48 h 內(nèi)結(jié)果RSD 為1.9%，表明供試品溶液48 h 內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取樣品，照“供試品溶液的制備”項(xiàng)下方法，平行制備6 份溶液，并按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件檢測(cè)，結(jié)果測(cè)得醋酸曲安奈德平均含量為17.4 μg/cm2，6 份樣品RSD 為1.8%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.6 回收率試驗(yàn) 取樣品20 片，除去蓋襯，精密稱定，剪成小塊（約0.25 cm2），取約1 片量，精密稱定，置分液漏斗中，按表2 加入對(duì)照品，照“供試品溶液制備”項(xiàng)下方法自“加50 mL 正辛烷……”進(jìn)行處理，得供試品溶液，并按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件檢測(cè)，結(jié)果顯示，低、中、高三個(gè)濃度回收率在98.5%～100.6%，平均回收率為99.4%，9 份回收率RSD 為0.7%，表明該方法準(zhǔn)確度良好，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.3.7 耐用性試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液分別對(duì)柱溫、流速、色譜柱、儀器進(jìn)行耐用性試驗(yàn)考察，通過(guò)改變柱溫25 ℃、30 ℃、40 ℃，改變流速0.8、1.0、1.2 mL/min，更換不同品牌色譜柱CAPCELL PAK C18 MG Ⅱ（4.6 mm×250 mm，5 μm），phenomenex Luna C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）及不同品牌高效液相色譜儀島津LC-2010，Agilent 1260，進(jìn)行方法耐用性試驗(yàn)，結(jié)果顯示各峰理論塔板數(shù)、分離度均能達(dá)到檢測(cè)要求，表明方法耐用性較好。

2.4 樣品含量測(cè)定

取3 個(gè)廠家的3 批樣品，分別照“供試品溶液制備”項(xiàng)下方法，制備供試品溶液，每批樣品制備2 份，并按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件檢測(cè)，計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同生產(chǎn)廠家醋酸曲安奈德測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 方法建立的意義

曲安奈德新霉素貼膏現(xiàn)行法定標(biāo)準(zhǔn)中，未對(duì)醋酸曲安奈德的含量進(jìn)行控制。近十年文獻(xiàn)顯示，僅兩篇文獻(xiàn)報(bào)道了該品種含量測(cè)定方法，均使用石油醚提取后再用乙醇沉淀的方法［10-11］。實(shí)際操作過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，由于貼膏劑基質(zhì)復(fù)雜，處方中含有天然橡膠，且各企業(yè)生產(chǎn)工藝各不相同，復(fù)雜的樣品前處理過(guò)程，導(dǎo)致平均回收率僅能達(dá)到92%［1］，因此有必要建立一個(gè)快速、簡(jiǎn)便、可靠、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好的方法，為該制劑的質(zhì)量控制提供方法依據(jù)。

3.2 提取方法的制定

3.2.1 提取溶劑的選擇 法定檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)中測(cè)定含膏量時(shí)，采用了90～120#汽油作為溶劑，本實(shí)驗(yàn)分別對(duì)97#汽油、93#汽油、石油醚、正辛烷進(jìn)行了考察。采用浸泡半小時(shí)、振搖、待膏體全部溶解后分次加入50 mL 乙醇萃取的方法進(jìn)行提取［10］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，加入石油醚、97#汽油、93#汽油溶解的膏體有沉淀產(chǎn)生，而正辛烷作為溶劑時(shí)，加入乙醇后無(wú)沉淀產(chǎn)生，出現(xiàn)分層現(xiàn)象，且測(cè)定結(jié)果顯示，正辛烷提取效率優(yōu)于93#汽油、97#汽油和石油醚，93#汽油、97#汽油較難獲取，因此選擇正辛烷作為提取溶劑。

3.2.2 方法準(zhǔn)確性驗(yàn)證 選取正辛烷為提取溶劑，分別制備3 份供試品溶液及3 份回收率實(shí)驗(yàn)溶液，結(jié)果表明，3 份供試品含量的RSD 為5.0%，回收率在92.6%～110.0%之間，RSD 為8.6%，證明提取平行性較差，導(dǎo)致結(jié)果準(zhǔn)確度下降。參考《中國(guó)藥典》2020 年版二部中醋酸曲安奈德乳膏［12］，加入炔諾酮作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定。

3.2.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化提取方法 考慮到樣品基質(zhì)復(fù)雜，提取過(guò)程繁瑣，通過(guò)設(shè)計(jì)一個(gè)三因素三水平的實(shí)驗(yàn)，分別選定萃取用乙醇濃度、萃取次數(shù)、裁剪大小作為三個(gè)因素，每個(gè)因素設(shè)計(jì)三個(gè)水平，按L9（34）正交表安排實(shí)驗(yàn)，9 組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響最大的因素是萃取用乙醇的濃度，提取最佳條件是將貼膏剪成0.25 cm2的小塊，用90%乙醇萃取4 次。