周金鳳，曾憲晶，劉姝，袁金華，龍菲

井岡山大學附屬醫(yī)院，江西 吉安 343000

缺血性腦血管病（ischemic cerebrovascular disease，ICD）是一類因腦局部血液循環(huán)中斷引起的神經(jīng)功能障礙性疾病，具有高發(fā)病率、高病死率、高致殘率的特點。隨著我國人口老齡化加快，腦血管疾病已經(jīng)成為致死、致殘的主要疾病之一，其中缺血性腦卒中最為突出，約占腦血管疾病的70%［1］。目前對ICD 尚缺乏有效的防治手段，給患病家庭帶來沉重的醫(yī)療負擔。研究表明：腦缺血缺氧發(fā)生后，細胞炎性因子參與啟動腦缺血損傷炎癥反應程序，炎性反應在急性腦缺血損傷過程中扮演重要角色，并可影響患者預后［2］。因此，早期積極有效干預缺血損傷所致的炎癥級聯(lián)反應程序的啟動是防治腦損傷加劇的重要環(huán)節(jié)。

在探究腦損傷治療過程中，通過藥物預處理干預手段來誘導腦缺血耐受被證明是一種能有效減輕腦損傷的方法［3］。瑞芬太尼作為μ 型阿片受體激動劑，能誘導產(chǎn)生預處理樣腦保護作用，我們在前期試驗中發(fā)現(xiàn)瑞芬太尼預處理具有抑制神經(jīng)元壞死和凋亡作用［4］。本實驗通過進一步探究瑞芬太尼預處理對急性腦缺血損傷大鼠炎性因子表達影響的變化，繼續(xù)探究其對腦損傷的作用機制，為臨床應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與造模方法

健康SPF 級SD 大鼠60 只，鼠齡（12～15 周），空白組6 只，假手術(shù)組、急性腦缺血組、瑞芬太尼預處理組，每組各18 只，體質(zhì)量（250±50）g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，實驗單位使用許可證編號為：SYXK 2012-0001，生產(chǎn)許可證號：SCXK 2016-0002，在動物實驗房適應性喂養(yǎng)1 周后，參照longa 法［5］制備大鼠腦缺血損傷模型（MCAO）。造模成功后將各組在不同處死時間點6 h、12 h、24 h 進一步分為3 個亞組，每亞組6 只。假手術(shù)組：僅行左側(cè)頸總動脈分離，縫合，不行血管結(jié)扎也不做缺氧缺血處理。瑞芬太尼預處理組：術(shù)前2 h 將大鼠裝入鼠盒固定，行尾靜脈穿刺并留置靜脈套管針，接微量泵輸入瑞芬太尼（人福醫(yī)藥公司，國藥準字H20030197），給藥劑量參照人與動物體表面積折算的等效劑量系數(shù)折算法［6］，每次輸注5 min，連續(xù)3次，輸注速率為0.8 μg·kg-1·min-1，每次輸注完后給予5 min 間歇期，整個預處理過程約30 min。急性腦缺血組：操作步驟同瑞芬太尼預處理組，輸注等量生理鹽水代替瑞芬太尼。大腦MCAO 造模成功的標準：（1）患側(cè)右前爪部分屈曲或完全屈曲；（2）行走時身體向偏癱側(cè)轉(zhuǎn)圈；（3）行走時身體向偏癱側(cè)跌倒。

1.2 取樣、切片制作

大鼠予10%水合氯醛麻醉后固定，剪開胸腹腔，暴露心臟，通過心臟快速灌注約100 mL 生理鹽水，灌洗至肝臟變白，右心耳流出清亮液體后，再灌注4%多聚甲醛（PFA）溶液約150 mL 固定，至大鼠尾巴及四肢強直僵硬后，撬開顱骨，完整取腦放入生理鹽水中漂洗殘血后，置于4%多聚甲醛中固定。24 h 后腦組織取出切塊，經(jīng)不同梯度乙醇脫水，浸蠟，石蠟包埋，用切片機制作約4 μm 厚度的冠狀切片，常規(guī)HE 染色后，光鏡下觀察缺血側(cè)腦組織神經(jīng)細胞形態(tài)病理變化。

1.3 RT-PCR 檢測TNF-α、IL-6 及IL-8 表達水平

將大鼠缺血側(cè)腦組織切下冷凍磨碎，勻漿處理至組織完全裂解，提取mRNA 后進行反轉(zhuǎn)錄，接著將獲得的QPCR 引物與模板進行擴增，TNF-α、IL-6、IL-8 mRNA 與β-actin 的引物用Primer 5.0軟件設計，交由上海生工股份有限公司合成，合成得到的引物為凍干粉末，取適量的無酶水進行溶解，得到100 μM 的引物母液，稀釋成PCR 擴增所需引物濃度為2 μM，序列如下見表1，結(jié)果計算：采用的內(nèi)參基因為β-actin，LC 480 檢測得出的CT 值為cDNA 熒光強度達到所設定閾值的循環(huán)數(shù)，ΔCt=目的基因CT 值-內(nèi)參基因CT 值。每個樣品中mRNA 相對表達量=2-ΔCt×100%

表1 PCR引物序列

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能缺損評分

空白組與假手術(shù)組大鼠的無神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)，在各時間點評分均無明顯變化；急性腦缺血組和瑞芬太尼預處理組大鼠在術(shù)后均出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能缺損癥狀，與腦缺血組相比，瑞芬太尼預處理組大鼠神經(jīng)功能缺損評分減輕，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 各組大鼠在不同時間點神經(jīng)功能缺損評分（分，，n=6）

表2 各組大鼠在不同時間點神經(jīng)功能缺損評分（分，，n=6）

注：與空白組及假手術(shù)組比較，aP＜0.01；與急性腦缺血組比較：bP＜0.05。

2.2 TTC 染色缺血側(cè)腦組織結(jié)果分析

每組隨機選取一塊腦組織，加以修整，漂洗殘血后放入4% PBS 固定、冰凍、切片，最后置于2% TTC 染色液中均勻染色。正常腦組織染色呈紅色，梗死區(qū)呈現(xiàn)灰白色。結(jié)果可見：假手術(shù)組腦切片染色未見明顯異常，腦缺血組和瑞芬太尼預處理組大鼠腦組織樣本均可見大小不等、界線清晰的蒼白色梗死區(qū)域；與腦缺血組相比，瑞芬太尼預處理組大鼠腦梗死體積明顯縮小（P＜0.05）。見表3、圖1。

圖1 各組大鼠TTC染色缺血側(cè)腦組織梗死體積圖（肉眼可視圖）

表3 各組大鼠腦組織梗死體積比較（，n=6）

表3 各組大鼠腦組織梗死體積比較（，n=6）

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.01；與急性腦缺血組比較，bP＜0.05。

2.3 大鼠腦組織HE 染色結(jié)果分析

大鼠腦組織HE 染色結(jié)果見圖2。圖2A、圖2B為空白組及假手術(shù)組神經(jīng)元染色情況，切片見大鼠神經(jīng)元形態(tài)完整，呈圓或橢圓形，排列整齊，核仁明顯，胞核染色清晰均勻。

圖2C、圖2D 是腦缺血組在處死點6 h、24 h染色情況，鏡下6 h 時見胞體腫脹，缺血周圍區(qū)明顯水腫，梗死區(qū)域神經(jīng)元結(jié)構(gòu)模糊，排列不齊。在24 h 時神經(jīng)元壞死和凋亡明顯，水腫、腫脹減輕，胞體縮小，見大量固縮變性壞死神經(jīng)細胞，細胞核消失，部分區(qū)域核固縮深染，邊緣區(qū)炎性細胞浸潤，胞質(zhì)內(nèi)形成微空泡。

圖2E、圖2F 為瑞芬太尼預處理組在處死點6 h、24 h 染色情況，在6 h 時細胞多層密集排列，胞膜較完整，水腫不明顯，在24 h 時部分神經(jīng)元胞體縮小，色深染，周圍見少量固縮壞死神經(jīng)元，炎性細胞浸潤及少量膠質(zhì)細胞增生，整體病理改變較腦缺血組減輕。

圖2 各組大鼠缺血側(cè)腦組織切片HE染色（×400）

2.4 各組大鼠腦組織TNF-α、IL-6 及IL-8 mRNA表達水平

大鼠造模后，空白組和假手術(shù)組的TNF-α、IL-6、IL-8 mRNA 表達水平兩組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與空白組及假手術(shù)組兩組比較，急性腦缺血組和瑞芬太尼預處理組TNF-α、IL-6及IL-8 mRNA 表達水平在各時間點均明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與急性腦缺血組同時間點相比，瑞芬太尼預處理組的TNF-α、IL-6、IL-8 mRNA 表達水平明顯低于腦缺血組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表4～6。

表4 各組大鼠腦組織TNF-α mRNA表達影響（，n=6）

表4 各組大鼠腦組織TNF-α mRNA表達影響（，n=6）

注：與空白、假手術(shù)組比較：aP＜0.01；與急性腦缺血組比較：bP＜0.05。

表5 各組大鼠腦組織IL-6 mRNA表達影響（，n=6）

表5 各組大鼠腦組織IL-6 mRNA表達影響（，n=6）

注：與空白、假手術(shù)組比較：aP＜0.01；與急性腦缺血組比較：bP＜0.05。

表6 各組大鼠腦組織IL-8 mRNA表達影響（，n=6）

表6 各組大鼠腦組織IL-8 mRNA表達影響（，n=6）

注：與空白組、假手術(shù)組比較：aP＜0.01；與急性腦缺血組比較：bP＜0.05。

3 討論

腦缺血損傷后，大量炎性因子的釋放與聚集會對神經(jīng)元造成損傷或凋亡，進而誘發(fā)腦組織損傷［7］，其中機制之一啟動了炎癥級聯(lián)反應程序，隨著炎性因子釋放與聚集的增加，神經(jīng)元損傷進一步加重，使缺血性損傷向炎癥性損傷轉(zhuǎn)變，進而促使炎癥級聯(lián)反應放大，其過程涉及多種炎性細胞因子參與，以TNF-α、IL-6、IL-8 等為代表的炎性遞質(zhì)失控釋放而形成的“瀑布效應”是腦缺血損傷的免疫炎癥反應的基礎［8］。TNF-α 是TNF 活性成分，既能調(diào)節(jié)機體免疫，控制IL-8、IL-6 等諸多炎性遞質(zhì)的生成及分泌，又可參與血管內(nèi)皮損傷及凝血過程，在腦缺血性損傷中扮演重要角色［9］。IL-6 升高可致中性粒細胞趨化到炎癥損傷的局部，分泌大量炎性遞質(zhì)，促進炎癥瀑布形成，加重炎癥損傷，影響神經(jīng)細胞的修復［10］。IL-8 屬于炎性反應型或誘導型的趨化性細胞因子，具有中性粒細胞趨化劑的所有特性，可誘導形態(tài)改變及趨化、細胞內(nèi)游離Ca2+濃度一過性升高、顆粒內(nèi)含物釋放、黏附蛋白上調(diào)等，從而促進炎性反應［11］。腦損傷越重，炎性遞質(zhì)釋放越明顯，TNF-α 可促進腦損傷中的IL-8、IL-6 等因子的mRNA 轉(zhuǎn)錄及表達，而IL-8、IL-6則進一步刺激TNF-α 活化，協(xié)同起促炎作用。

缺血性腦損傷的病理生理機制復雜，目前尚缺乏有效的干預方法。近年來動物試驗研究表明：藥物預處理可能是防治缺血損傷的有效手段，部分臟器在經(jīng)歷一次或多次的短暫缺血后，對隨后發(fā)生的長時間缺血有很好的耐受力，可明顯減輕缺血所致的損傷。在藥物預處理過程中，麻醉性鎮(zhèn)痛藥品是近年來預處理藥物選擇的熱點之一。有關(guān)阿片類藥物對腦缺血再灌注損傷的研究結(jié)果表明：δ、μ、κ 受體均參與了減輕腦缺血再灌注損傷的保護機制［12-13］。研究表明瑞芬太尼能調(diào)節(jié)線粒體的功能，μ 受體和δ 受體均是通過G 蛋白和K+通道相偶聯(lián)，這兩種阿片受體被激動后均可引起K+通道開放［14］，線粒體ATP 敏感性鉀通道的開放，可減輕線粒體過氧化損傷而可能具有減輕腦缺血再灌注損傷的作用，而δ受體激活可減少谷氨酸鹽和組織缺氧所引起的神經(jīng)元的死亡［15］。此外，阿片受體通過降低環(huán)磷酸腺苷（cAMP）產(chǎn)生，減輕激活蛋白激酶A（PKA），從而PKA 對Ca2+激活的鉀通道抑制作用減弱，細胞膜去極化作用減弱，Glu 釋放減少，NMDA 受體激活減少，Ca2+內(nèi)流減少，減輕“鈣超載”，從而發(fā)揮腦保護作用［16］。本實驗中瑞芬太尼預處理組TNF-α、IL-6、IL-8 表達水平在各時間點明顯低于急性腦缺血組，且神經(jīng)細胞的病理反應減輕，提示瑞芬太尼預處理具有減輕炎性因子的作用，與臨床報道一致［17］。

綜上所述，瑞芬太尼預處理后大鼠腦梗死體積縮小，神經(jīng)元病理反應減輕，腦組織炎性因子表達降低，表明瑞芬太尼預處理對急性腦缺血損傷具有一定的保護作用。