任曉慶 李琪 閆本純 馬思琦 李晨 李春燕 樊金宇 閆海潤

彌散性血管內(nèi)凝血（DIC）是感染性疾病危及生命的嚴重并發(fā)癥。據(jù)報道，膿毒癥患者合并DIC的發(fā)生率達30%～50%，并且其死亡率增加1倍[1]。典型的DIC診斷并不難，但診斷時往往已發(fā)展至中晚期，死亡率較高，故尋找能夠早期診斷膿毒癥合并DIC的新型標志物至關(guān)重要。當病原菌入侵機體，免疫系統(tǒng)激活、炎癥介質(zhì)和組織因子大量釋放，隨后引發(fā)凝血級聯(lián)反應(yīng)，這被認為是膿毒癥引發(fā)DIC的主要病理生理機制[2，3]。

補體系統(tǒng)是非特異性免疫系統(tǒng)的重要組成部分。補體系統(tǒng)包括經(jīng)典途徑、旁路途經(jīng)和凝集素途徑，其中MASP-1是凝集素途徑的重要蛋白酶，凝集素途徑會識別病原體表面上的碳水化合物，導致MASP-1激活，隨后激活補體的共同途徑[4]。MASP-1是炎癥反應(yīng)中凝血系統(tǒng)和補體系統(tǒng)之間的重要交叉點，由于其具有類似凝血酶的活性，它能夠裂解纖維蛋白原和凝血因子ⅩⅢ[5]，從而激活凝血系統(tǒng)；隨后纖維蛋白的形成和凝血因子的釋放亦可激活補體系統(tǒng)，使補體蛋白MASP-1的表達增加，最終導致凝血和補體級聯(lián)反應(yīng)的激活進一步增強。膿毒癥DIC的發(fā)生發(fā)展主要歸因于補體系統(tǒng)和凝血系統(tǒng)的功能紊亂。因此，補體蛋白MASP-1在膿毒癥合并DIC中具有重要的調(diào)控作用。在細胞實驗和動物實驗等基礎(chǔ)實驗中，MASP-1與凝血系統(tǒng)之間的關(guān)系已得到證實[6，7]，然而，尚缺乏驗證這一觀點的臨床研究。本研究探討MASP-1與膿毒癥患者凝血功能紊亂的關(guān)系，分析MASP-1與TAT、TM、t-PAIC三項血栓分子標志物之間的相關(guān)性，評估其對膿毒癥合并DIC的早期診斷價值。

1 材料與方法

1.1 一般資料 選取我院2019年10月～2021年8月收治的膿毒癥患者，參照膿毒癥3.0診斷標準[8]；排除年齡小于18歲、懷孕、重大創(chuàng)傷或手術(shù)、2周內(nèi)使用過抗凝藥物、惡性血液系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病、嚴重肝腎疾病、惡性腫瘤等患者。本次研究符合收集標準的患者共106例，其中男58例，女48例，平均年齡（63.06±13.42）歲。按國際血栓與止血協(xié)會標準（ISTH）[9]，將患者分為DIC組（23例）和非DIC組（83例）。DIC組男14例，女9例，平均年齡（67.37±15.77）歲；高血壓10例，糖尿病4例，冠心病7例。非DIC組男44例，女39例，平均年齡（66.18±15.47）歲；高血壓29例，糖尿病11例，冠心病26例。以同期門診健康體檢者60例作為對照組，其中男34例，女26例，平均年齡（59.33±11.02）歲。三組之間年齡和性別差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），且DIC組與非DIC組之間基礎(chǔ)疾病差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），均具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核批準，患者或其家屬簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 樣本收集 連續(xù)收集被確診為膿毒癥患者的血漿，對患者臨床資料進行動態(tài)觀察，將符合DIC診斷標準的患者納入DIC組，否則納入非DIC組。用含0.3ml 3.2%枸櫞酸鈉抗凝劑的采血管抽取患者及對照組的血液2.7ml，上機離心10min（3 000r/min），將上層血漿轉(zhuǎn)移至新的離心管中，30min內(nèi)于-80℃冰箱凍存。檢測前所有樣本1次室溫復溶后檢測。

1.2.2 檢測方法 MASP-1的測定采用酶聯(lián)免疫測定法，儀器為Infinite M200 PRO多功能酶標儀，試劑為MASP-1酶聯(lián)免疫分析試劑盒。TAT、TM和t-PAlC的測定采用化學發(fā)光免疫分析法，儀器為HISCL-5000全自動化學發(fā)光儀器，試劑為配套化學發(fā)光試劑。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 23.0軟件對各組數(shù)據(jù)進行分析。呈偏態(tài)分布的計量資料用M（P25，P75）表示，計數(shù)資料的組間比較采用χ2檢驗。繪制受試者工作特征曲線（ROC曲線），以判斷各項標志物的診斷性能。相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 三組血漿中MSAP-1、TAT、TM和t-PAIC表達水平比較 DIC組患者血漿中MASP-1、TAT、TM和t-PAIC表達水平均高于非DIC組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；且兩組患者上述各指標水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），見表1。

表1 三組血漿中MSAP-1、TAT、TM和t-PAIC表達水平比較（±s）

表1 三組血漿中MSAP-1、TAT、TM和t-PAIC表達水平比較（±s）

注：與對照組相比，*P<0.05；與非DIC組相比，#P<0.05

組別 n MASP-1（μg/ml） TAT（ng/ml） TM（TU/ml） t-PAIC（ng/ml）對照組 60 12.9（9.13，15.3） 1.81（1.18，3.49） 8.54（7.41，10.04） 6.36（4.56，8.45）非DIC組 83 28.7（19.9，37.6）* 5.1（3.0，8.1）* 14.0（10.0，20.0）* 13.1（7.7，21.6）*DIC組 23 35.3（26.2，41.6）*# 11.6（3.6，25.0）*# 19.2（12.3，33.4）*# 21.1（13.7，32.8）*#

2.2 MASP-1與TM、TAT、t-PAIC的相關(guān)性 Spearman相關(guān)性分析顯示，膿毒癥患者MASP-1水平與TAT水平呈正相關(guān)（r=0.7447，P<0.001），與TM水平正相關(guān)（r=0.6362，P<0.001），與t-PAIC水平呈正相關(guān)（r=0.6241，P<0.001），見圖1。

圖1 MASP-1與TM、TAT、t-PAIC的相關(guān)性

2.3 MASP-1、TAT、TM和t-PAIC對膿毒癥合并DIC的診斷效能 采用ROC曲線分析MASP-1、TAT、TM和t-PAIC對膿毒癥合并DIC的診斷效能，曲線下面積分別為0.695、0.705、0.674、0.661；MASP-1和TAT、TM、t-PAIC聯(lián)合檢測的曲線下面積最大（0.751），敏感度為51.0%，特異性為87.6%，見表2、圖2。

圖2 各分子標志物診斷膿毒癥合并DIC的ROC曲線

表2 各分子標志物對膿毒癥合并DIC的診斷價值

3 討論

膿毒癥發(fā)生時，由于病原菌入侵，機體固有免疫系統(tǒng)激活，導致凝血和補體級聯(lián)反應(yīng)增強，嚴重者會發(fā)生全身微血管血栓形成，進而引起膿毒癥合并DIC。膿毒癥合并DIC的病理生理機制較為復雜，是多種因素共同作用的結(jié)果。凝集素途徑在先天性免疫中具有重要意義，并且補體蛋白MASP-1與凝血系統(tǒng)功能紊亂密切相關(guān)，可能是膿毒癥患者發(fā)生DIC的重要機制。體外細胞實驗研究顯示，MASP-1可裂解凝血酶原，其裂解方式與FXa介導的凝血酶原裂解相似，是凝血酶的另一種活化形式，可使TAT生成增加[10]；并且MASP-1具有切割和激活纖維蛋白原和因子ⅩⅢ的能力，可以驅(qū)動交聯(lián)纖維蛋白原的形成并使其穩(wěn)定，加速血凝塊形成[11]。本研究在臨床研究中進一步探討了膿毒癥患者MASP-1對凝血系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用。ISTH評分是膿毒癥凝血功能障礙的公認評分系統(tǒng)，但此評分系統(tǒng)有一定的局限性，因為血小板、纖維蛋白原和纖維蛋白降解產(chǎn)物都是急性反應(yīng)物。為對凝血功能進行全面了解，本研究進一步測定了TAT血清水平。結(jié)果顯示，DIC組和非DIC組的TAT水平明顯高于對照組，說明膿毒癥患者普遍存在血液高凝狀態(tài)，凝血酶活性明顯高于對照組；DIC組明顯高于非DIC組，說明DIC患者血液高凝狀態(tài)更加嚴重。DIC組MASP-1表達水平明顯高于非DIC組，且兩組均高于對照組。Spearman相關(guān)性分析顯示，MASP-1與TAT呈正相關(guān)，TAT是凝血酶生成的分子標志物，說明MASP-1的激活增加與膿毒癥的嚴重程度和凝血相關(guān)疾病密切相關(guān)，與Jenny等[5]研究中MASP-1可以增強微血管流動模型中的血凝塊形成觀點一致。因此，MASP-1可作為膿毒癥相關(guān)凝血功能障礙發(fā)生和嚴重程度的潛在生物標志物，其臨床實用性需進一步驗證。

膿毒癥時內(nèi)皮細胞作為病原體及其毒素的靶細胞，易被過度活化的炎癥介質(zhì)損傷，同時抑制蛋白質(zhì)C的激活和抗凝血酶的釋放，導致機體內(nèi)的凝血-抗凝系統(tǒng)失衡，增加了發(fā)生DIC的風險。TM和t-PAIC被認為是內(nèi)皮細胞損傷的生物標志物，膿毒癥合并DIC患者血漿中TM和t-PAIC水平升高已被證實[12]。Debreczeni等[13]研究顯示，MASP-1可通過裂解蛋白酶激活的受體4激活內(nèi)皮細胞，介導中性粒細胞和內(nèi)皮細胞上的TF表達、激活的內(nèi)皮細胞和血小板上P-選擇素的暴露增加及內(nèi)皮細胞分泌炎性因子，促進炎癥反應(yīng)，從而增強內(nèi)皮損傷[14，15]。因此，MASP-1與膿毒癥合并DIC患者的內(nèi)皮損傷密切相關(guān)。本研究結(jié)果表明，DIC組TM、t-PAIC水平顯著高于非DIC組，并且Spearman相關(guān)性分析顯示，MASP-1與TM和t-PAIC水平分別呈正相關(guān)，TAT和t-PAIC作為內(nèi)皮細胞損傷的生物標志物，說明MASP-1是膿毒癥患者發(fā)生DIC的內(nèi)皮細胞損傷的重要病理因素。采用ROC曲線評估MASP-1、TAT、TM和t-PAIC對膿毒癥合并DIC的診斷效能，結(jié)果顯示單獨指標中TAT對膿毒癥合并DIC的診斷性能最高（0.705），其次為MASP-1（0.695），t-PAIC的診斷效能最差（0.661）；MASP-1和TAT、TM、t-PAIC聯(lián)合檢測的曲線下面積最大（0.751），敏感度為51.0%，特異性為87.6%。說明膿毒癥患者的補體蛋白MASP-1與DIC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。MASP-1作為膿毒癥相關(guān)DIC治療的生物標志物或靶標的潛力需在今后的研究中加以探討。后續(xù)將擴大樣本量，增加凝集素途徑其他蛋白的臨床研究以及更全方面的方法學來證實本研究觀點。

綜上所述，MASP-1與膿毒癥患者凝血功能紊亂和內(nèi)皮細胞損傷密切相關(guān)，為探討膿毒癥患者合并DIC的發(fā)生機制提供了新思路。ROC曲線顯示MASP-1可作為膿毒癥患者合并DIC的早期新型標志物，具有較理想的診斷價值；MASP-1聯(lián)合血栓分子標志物對膿毒癥合并DIC的診斷價值更高，可為臨床早發(fā)現(xiàn)、早治療及改善預后提供重要依據(jù)。