王少波 郭躍 曾昊 龐志剛

2020年肝癌的發(fā)病率位于全世界惡性腫瘤第六位，病死率位于第三位[1]。肝癌最主要的危險因素是乙型肝炎病毒感染和黃曲霉毒素暴露，此外，酒精、非酒精性脂肪肝、糖尿病、吸煙等危險因素也與肝癌有密切關(guān)系[1，2]。肝細胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是肝癌最常見的類型，占肝癌病例的75%～85%。HCC有手術(shù)切除、消融、化療栓塞和肝移植等治療方法[3]，但由于病因復(fù)雜和腫瘤的高度異質(zhì)性[4]，腫瘤往往進展至晚期才被診斷，有效的治療方法有限，往往導(dǎo)致預(yù)后不良[5]。因此有必要開發(fā)一種新的HCC預(yù)后預(yù)測模型為HCC的診療策略提供新思路。

腫瘤耐藥的主要原因之一是癌細胞在死亡的執(zhí)行過程中存在缺陷[6]，鐵死亡是2012年由Dixon等人發(fā)現(xiàn)的一種由脂質(zhì)過氧化和活性氧累積所驅(qū)動的調(diào)節(jié)性細胞死亡方式[7]。近年來有研究發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)腫瘤細胞鐵死亡可用于癌癥治療，特別是對傳統(tǒng)療法有抵抗力的侵襲性惡性腫瘤[8]。

長鏈非編碼RNA（LncRNA）是長度超過200個堿基的非編碼RNA，在基因調(diào)控方面發(fā)揮重要作用[9]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)LncRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用[10]。目前關(guān)于鐵死亡相關(guān)LncRNA的研究較少，最近的一項研究發(fā)現(xiàn)核LncRNA LINC00336作為競爭的內(nèi)源性RNA，在肺癌中上調(diào)并發(fā)揮癌基因作用，通過與RNA結(jié)合蛋白ELAVL1相結(jié)合抑制腫瘤細胞鐵死亡[11]。在一項研究中發(fā)現(xiàn)，LncRNA LINC00618在人類白血病細胞中通過增加脂質(zhì)ROS和鐵的水平，同時降低SLC7A11的表達來促進鐵死亡，此外還能促進長春新堿誘導(dǎo)的鐵死亡和細胞凋亡[12]。然而，目前關(guān)于肝癌患者鐵死亡相關(guān)LncRNA特征及其與總生存期的相關(guān)性研究較少，本研究中，我們基于The Cancer Genome Atlas（TCGA）數(shù)據(jù)庫構(gòu)建鐵死亡相關(guān)LncRNA預(yù)測模型，并對其功能富集和免疫相關(guān)功能進行分析，探討其可能存在的機制。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)預(yù)處理 通過在TCGA數(shù)據(jù)庫下載FPKM標(biāo)準(zhǔn)化的374例HCC組織和50例正常組織的RNA-seq轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，同時下載對應(yīng)臨床數(shù)據(jù)，主要臨床信息包括年齡、性別、生存時間、生存狀態(tài)、組織學(xué)分級、腫瘤TNM分期。鐵死亡相關(guān)基因通過FerrDb數(shù)據(jù)庫下載。FerrDb數(shù)據(jù)庫是一個由人工收集管理的鐵死亡相關(guān)標(biāo)志物和調(diào)控因子以及鐵死亡關(guān)聯(lián)疾病的數(shù)據(jù)庫[13]。通過FerrDb數(shù)據(jù)庫共下載鐵死亡相關(guān)基因382個，其中有246個鐵死亡相關(guān)基因在TCGA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中有表達。使用Pearson相關(guān)性分析法將鐵死亡基因和LncRNA進行共表達分析確定鐵死亡相關(guān)LncRNA，篩選條件為r>0.5，P<0.001。

1.2 差異基因分析 使用R軟件4.0.3版本“l(fā)imma”包對374例HCC組織和50例正常組織的鐵死亡相關(guān)基因進行差異表達分析，篩選條件為P<0.05，|log2FC|>1。利用R軟件“clusterProfiler”包對鐵死亡相關(guān)差異表達基因進行基因本體論（GO）富集分析，包括生物學(xué)過程（BP）、細胞組成（CC）和分子功能（MF），同時進行京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析。

1.3 鐵死亡預(yù)后相關(guān)LncRNA模型的構(gòu)建與驗證 對上述鐵死亡相關(guān)LncRNA使用R軟件“survival”包進行單因素COX回歸分析，獲取與預(yù)后相關(guān)的LncRNA（P<0.01），再對預(yù)后相關(guān)的LncRNA進行多因素COX回歸分析，建立預(yù)后模型，計算每例患者的風(fēng)險分?jǐn)?shù)，根據(jù)中位風(fēng)險值將病例分為低風(fēng)險組和高風(fēng)險組。使用KM法分析低風(fēng)險組和高風(fēng)險組的生存時間差異，從而確定風(fēng)險評分對HCC患者預(yù)后的預(yù)測作用。對患者年齡、性別、組織學(xué)分級、臨床分期、風(fēng)險評分分別進行單因素和多因素COX獨立預(yù)后分析，從而觀察風(fēng)險評分是否可以獨立于其他臨床特征作為新的預(yù)后因子。通過受試者工作特征（ROC）曲線評價預(yù)后模型的預(yù)測性能。

1.4 通路富集分析和免疫相關(guān)功能研究 通過GSEA富集分析探索鐵死亡相關(guān)LncRNA預(yù)測模型下高、低風(fēng)險組富集通路特征，通過ssGSEA算法評估高、低風(fēng)險組的免疫細胞成分，并對高、低風(fēng)險組腫瘤浸潤性免疫細胞亞群、免疫功能和免疫檢查點之間的差異進行評估。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 使用R軟件4.0.3版本進行數(shù)據(jù)分析和圖形可視化處理，采用 COX 回歸模型篩選與HCC患者預(yù)后相關(guān)的LncRNA并構(gòu)建風(fēng)險評分模型。采用時間依賴的ROC曲線評估模型的預(yù)測性能，根據(jù)此模型對HCC患者進行Kaplan-Meier生存分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鐵死亡相關(guān)基因的富集分析 通過對TCGA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的鐵死亡相關(guān)基因進行差異分析，共得到84個鐵死亡相關(guān)基因，其中上調(diào)基因13個，下調(diào)基因71個。GO富集分析結(jié)果顯示鐵死亡相關(guān)基因參與BP中細胞化學(xué)應(yīng)激和氧化應(yīng)激反應(yīng)，在CC中主要參與煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶復(fù)合體和次級溶酶體的構(gòu)成，在MF方面與NADPH氧化酶活性有關(guān)。KEGG分析顯示高表達基因主要涉及鐵死亡、癌細胞碳代謝、5-羥色胺能突觸和VEGF信號通路等。見圖1。

圖1 鐵死亡相關(guān)差異表達基因的GO（A）和KEGG（B）分析

2.2 構(gòu)建鐵死亡相關(guān)LncRNA預(yù)后模型 通過基因共表達分析，共得到319個鐵死亡相關(guān)LncRNA，單因素COX分析得到了58個與預(yù)后顯著相關(guān)的LncRNA，多因素COX分析最終確定了22個LncRNA為獨立預(yù)后因素，風(fēng)險得分=-0.409×AC022007.1表達值+0.786×MKLN1-AS表達值+0.870×SNHG12表達值+0.635×Z95115.1表達值+1.077×PRRT3-AS1表達值+1.586×SREBF2-AS1表達值+1.094×MIR210HG表達值+1.248×AL050341.2表達值+0.899×LUCAT1表達值+1.342×NRAV表達值+1.396×LINC01224表達值+1.108×MIR4435-2HG表達值+1.220×LINC00205表達值+0.487×PTOV1-AS1表達值+0.320×AL671710.1表達值×1.069×ZFPM2-AS1表達值+0.526×AL357079.1表達值+1.639×AC145 207.5表達值+1.073×AC099850.3表達值+1.846×SNHG4表達值+2.689×KDM4A-AS1表達值+0.157×AC091057.1表達值。

2.3 驗證鐵死亡相關(guān)LncRNA預(yù)后模型 以風(fēng)險評分的中位值作為截斷值將患者分為高風(fēng)險組和低風(fēng)險組，見圖2，Kaplan-Meier分析顯示高風(fēng)險組患者的生存時間顯著小于低風(fēng)險組（P<0.001）。見圖3。將患者年齡、性別、組織學(xué)分級、臨床分期、風(fēng)險評分進行獨立預(yù)后分析，結(jié)果顯示臨床分期和風(fēng)險評分在單因素和多因素COX分析中差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001），ROC曲線對LncRNA預(yù)測模型的1年的生存預(yù)測性能評價顯示AUC=0.811，同時得到該模型3年和5年的生存預(yù)測性能AUC值分別為0.778和0.752。見圖4。

圖2 風(fēng)險評分與相關(guān)LncRNA表達熱圖及生存時間點圖

圖3 高、低風(fēng)險組的Kaplan-Meier分析

圖4 鐵死亡相關(guān)LncRNA單因素（A）和多因素COX分析（B）以及模型對1、3、5年生存率預(yù)測性能的AUC值（C）

2.4 基因富集分析 GSEA結(jié)果提示鐵死亡相關(guān)LncRNA預(yù)測模型的高風(fēng)險組中富集多條免疫和腫瘤相關(guān)通路，如錯配修復(fù)、Wnt信號通路、mTOR信號通路、MAPK信號通路、TGF-β信號通路、p53信號通路、VEGF信號通路、RIG-Ⅰ樣受體信號通路、T細胞受體信號通路、FcγR介導(dǎo)的吞噬作用、Toll樣受體信號通路、自然殺傷細胞介導(dǎo)的細胞毒作用等，而在低風(fēng)險組中則富集了多條與合成代謝相關(guān)通路，如脂肪酸代謝、膽汁酸合成、異生物質(zhì)代謝和部分氨基酸代謝等。見圖5。

圖5 鐵死亡相關(guān)LncRNA的GSEA

2.5免疫相關(guān)分析 基于ssGSEA算法對高、低風(fēng)險組腫瘤免疫浸潤程度進行評估，結(jié)果顯示免疫細胞和免疫功能中B細胞、NK細胞、中性粒細胞、肥大細胞、輔助性T細胞、細胞毒活性、MHCⅠ類分子、Ⅰ型和Ⅱ型干擾素反應(yīng)在高、低風(fēng)險組間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。由于免疫檢查點在免疫治療方面發(fā)揮重要作用，我們進一步探討了高、低風(fēng)險組間免疫檢查點的差異，結(jié)果顯示CTLA4、CD44、HHLA2、TMIGD2、TNFSF15等在兩組患者中的表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖6。

圖6 免疫細胞（A）與免疫相關(guān)功能（B）在高、低風(fēng)險組中的差異及免疫檢查點在高、低風(fēng)險組中的表達（C）

3 討論

腫瘤靶向治療過程中產(chǎn)生的耐藥機制已經(jīng)成為晚期腫瘤治療失敗的重要原因[14]，有研究表明，以FSP1/CoQ10軸為靶點的鐵死亡療法對于由細胞可塑性引起的耐藥機制有巨大的應(yīng)用潛力[15]，可用于預(yù)防各種來源的惡性腫瘤的治療抵抗或轉(zhuǎn)移。由于鐵死亡在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要作用，其相關(guān)的LncRNA也受到了特別關(guān)注[16]。本研究基于TCGA數(shù)據(jù)建立了一種新的鐵死亡相關(guān)LncRNA預(yù)后預(yù)測模型，該模型能較好地區(qū)分高低風(fēng)險人群，與傳統(tǒng)的臨床預(yù)后因素相比，該模型對于HCC預(yù)后預(yù)測的效能明顯提高。本模型共納入22個LncRNA，根據(jù)LncRNA在高、低風(fēng)險組間差異表達的熱圖可以看出，模型中所有LncRNA都傾向于在高風(fēng)險組中高表達，其中部分LncRNA被報道與各種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如有研究表明，MIR210HG在非小細胞肺癌的組織和細胞中過表達，沉默MIR210HG可抑制腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲，同時增加腫瘤細胞的放射敏感性和化學(xué)抗性[17]。MIR210HG高表達還與HCC的臨床分期晚、腫瘤體積大、有血管侵犯及組織分化不良有關(guān)，是影響患者總體生存的獨立不良預(yù)后因素[18]。另有研究表明，LINC01224可通過LINC01224/miR-330-5p/CHEK1軸參與HCC的發(fā)生發(fā)展[19]。在胃癌中LINC01224還可通過介導(dǎo)miR-193a-5p調(diào)控CDK8影響胃癌的生物學(xué)行為[20]。

在HCC腫瘤微環(huán)境中，由不同免疫抑制細胞亞群介導(dǎo)的促腫瘤免疫反應(yīng)在驅(qū)動免疫逃避中起關(guān)鍵作用。通過對高、低風(fēng)險組免疫評分分析發(fā)現(xiàn)，高風(fēng)險組人群中的NK細胞比例和Ⅰ型和Ⅱ型干擾素反應(yīng)較低，提示高風(fēng)險組中的腫瘤免疫抑制程度較高并導(dǎo)致預(yù)后較差。近年來基于免疫檢查點抑制的免疫療法已被證實能提升晚期腫瘤患者的生存率，本研究中高、低風(fēng)險組間免疫檢查點的顯著差異提示兩組人群可能對免疫療法的敏感程度不同。

本研究通過對TCGA數(shù)據(jù)庫HCC基因表達譜數(shù)據(jù)的挖掘，構(gòu)建了鐵死亡相關(guān)的LncRNA預(yù)測模型，可以較好地預(yù)測患者預(yù)后，相比于單個LncRNA位點具有更好的預(yù)測效果。然而本研究仍存在一定的不足之處，如該預(yù)測模型是基于公共數(shù)據(jù)庫TCGA的臨床信息和基因表達信息所建立的，還需要更多的臨床數(shù)據(jù)對其作用進行驗證，另一方面，未對該模型納入的LncRNA進行腫瘤機制實驗研究，對LncRNA如何影響腫瘤增殖轉(zhuǎn)移及預(yù)后尚不清楚，有待于進一步研究。