王化湘 劉光化 簡唯求 彭輝燦 李姣

近年來，隨著人們生活水平的提高，糖尿病在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率逐年上升[1]。作為一種嚴重危害人類健康的慢性代謝性疾病，糖尿病在發(fā)展過程中可能伴隨著腎功能衰竭、心血管疾病、視力損害等一系列并發(fā)癥[2，3]，給糖尿病患者帶來極大的負擔(dān)。其中糖尿病視網(wǎng)膜病變是糖尿病患者出現(xiàn)視力損害最嚴重的并發(fā)癥[4]，其病理改變是由于人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞（Human retinal micro- vascular endothelial cells，HRMEC）過度增殖導(dǎo)致的新血管生成，嚴重者甚至?xí)?dǎo)致視力完全喪失[5]。有研究發(fā)現(xiàn)，其可能與視網(wǎng)膜組織血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）異常表達有關(guān)，過度的VEGF表達能夠刺激血管內(nèi)皮細胞，提高其增殖與遷移能力，從而形成新的血管[6]。叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O3a（Forkhead box O3a，F(xiàn)OXO3a）是近些年來發(fā)現(xiàn)的一種新的轉(zhuǎn)錄因子，在動物中參與生長發(fā)育、細胞分化、代謝凋亡、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄和免疫等多種生物學(xué)進程，近期在血管生成過程中同樣發(fā)現(xiàn)FOXO3a發(fā)揮了一定的作用[6]。迷迭香酸是一種多酚酸，在現(xiàn)代藥理學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)其具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、抗病毒等多種功能[7]。目前有研究表明迷迭香酸能夠抑制VEGF的表達，對腫瘤細胞的增殖有抑制作用[8]，但對于糖尿病視網(wǎng)膜病變影響的相關(guān)研究較少。因此本實驗以HRMEC為研究對象，以高糖培養(yǎng)基模擬糖尿病高糖環(huán)境[9]，通過分子生物學(xué)技術(shù)分析迷迭香酸對高糖環(huán)境下HRMEC的影響及與FOXO3a/VEGF信號通路相關(guān)的可能機制，以期為糖尿病視網(wǎng)膜病變的臨床治療提供新的思路與理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑 人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮原代細胞購自上海中科院細胞庫；迷迭香酸購自上海恒斐生物科技有限公司；VEGF、FOXO3a、PCNA、CDK2、Cyclin A1抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；β-actin抗體購自美國貝博生物科技有限公司；PCR引物合成自上海生工生物工程股份有限公司；Trizol Reagent總RNA提取試劑盒購自美國英杰公司；MTT分析試劑盒購自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司；細胞周期檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；DMSO購自北京索萊寶生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；Western Blot相關(guān)試劑購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；胎牛血清購自美國Sigma公司；蛋白電泳儀與轉(zhuǎn)膜儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 細胞培養(yǎng) 將HRMEC置于加入了青霉素（100U/ml）、鏈霉素（0.1mg/ml）及10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，設(shè)置培養(yǎng)箱培養(yǎng)條件：37℃，含5%CO2；傳代條件：細胞密度>80%，以1：3的比例進行傳代培養(yǎng)。當(dāng)細胞處于對數(shù)生長期時進行試驗。

1.3 實驗分組及處理 將處于對數(shù)生長期的HRMEC分為6組?？瞻捉M：在原培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)；低糖組：在加入低糖培養(yǎng)液（0.5mmol/L）的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)；高糖組：在加入高糖培養(yǎng)液（25mmol/L）的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)；低劑量迷迭香酸組：在高糖培養(yǎng)液中加入12.5μmol/L迷迭香酸進行培養(yǎng)；中劑量迷迭香酸組：在高糖培養(yǎng)液中加入25μmol/L迷迭香酸進行培養(yǎng)；高劑量迷迭香酸組：在高糖培養(yǎng)液中加入50μmol/L迷迭香酸進行培養(yǎng)。

1.4 MTT檢測HRMEC增殖活性 取處于對數(shù)生長期的各組HRMEC，使其解離后以5×103細胞/孔的密度在96孔細胞培養(yǎng)板上進行培養(yǎng)，每組細胞設(shè)置5個復(fù)孔，在培養(yǎng)板邊緣孔中加入無酶水防止液體蒸發(fā)。將細胞繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72h后取出，隨后向每孔中避光加入20μl的MTT粉劑溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h后取出用PBS溶液洗滌，加入DMSO溶液20μl，使用酶標(biāo)儀在490nm波長下測量光密度（OD值），OD值越大代表細胞數(shù)量越多，細胞增殖活性越強。

1.5 流式細胞術(shù)檢測HRMEC周期 將經(jīng)處理后的HRMEC懸液離心后棄去上清液，加入預(yù)冷70%乙醇固定細胞2h，之后棄去上清液。使用細胞周期檢測試劑盒在避光環(huán)境下溶解，并恒溫孵育30min后使用流式細胞儀進行周期檢測，使用流式軟件CytExpert對細胞周期分布結(jié)果進行處理。

1.6 Real-time PCR 將收集到的處理后的HRMEC懸液離心后棄去上清液，向沉淀中加入適量Trizol試劑，在冰上孵育5～10min后加入預(yù)冷過的氯仿0.2ml。繼續(xù)冰上孵育5min后1 200r/min離心15min，轉(zhuǎn)移水相，加入等體積異丙醇后再次離心10min，棄上清液。加入預(yù)冷75%乙醇溶液洗滌，棄上清液后風(fēng)干，加入40～200μl的無酶水溶解制成RNA備用。通過制備的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后加入SYBR Green染料與VEGF的上下游引物混合離心（VEGF基因上游引物為5'-TCGAGACCCTGGTGGACATC-3'，下游引物為5'-CACACAGGACGGCTTGAAGA-3'；β-actin基 因上游引物為5'-TCAGGTCATCACTATCGGCAAT-3'，下游引物為5'-AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA-3'）。隨后于PCR儀上進行擴增，循環(huán)完成后做溶解曲線。以采集到的熒光信號值（Ct值）進行相對定量分析。

1.7 蛋白免疫印跡試驗（Western Blot） 將收集到的處理后的HRMEC懸液離心后棄去上清液，然后加入RIPA裂解液和PMSF蛋白酶抑制劑提取總蛋白，提取出的總蛋白放入10ml EP管中，加入十二烷基磺酸鈉混勻后放入95℃～100℃沸水中水煮變性后備用。將提取的總蛋白進行電泳、封閉及轉(zhuǎn)膜操作。轉(zhuǎn)膜后分別孵育VEGF（1：1000）、FOXO3a（1：1000）、PCNA（1：1000）、CDK2（1：1000）、Cyclin A1（1：1000）及β-actin（1：500）抗體與相對應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，最后將含有蛋白標(biāo)記的膜洗凈，涂上化學(xué)發(fā)光顯影液后通過顯影儀拍照，對結(jié)果用ImageJ軟件對各組HRMEC中不同因子的相對灰度值進行系統(tǒng)性分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準差（±s）表示，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，兩組間均數(shù)差異比較采用t檢驗，多組間均值差異比較采用F檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT檢測在高糖環(huán)境下不同濃度迷迭香酸對HRMEC增殖活性的影響 經(jīng)過MTT檢測OD值發(fā)現(xiàn)，低糖組中各時間段HRMEC數(shù)量均少于高糖組，高糖環(huán)境下培養(yǎng)的HRMEC經(jīng)不同濃度的迷迭香酸處理后，其細胞數(shù)量均有所降低，且隨著迷迭香酸濃度的增加以及干預(yù)時間的延長，HRMEC數(shù)量顯著下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

表1 不同時間點HRMEC數(shù)量的比較

2.2 流式細胞術(shù)檢測在高糖環(huán)境下不同濃度迷迭香酸對HRMEC周期分布的影響 用CytExpert軟件分析結(jié)果可發(fā)現(xiàn)與空白組及低糖組相比，高糖環(huán)境下HRMEC分布于S期的細胞數(shù)量顯著增加，G0/G1期數(shù)量顯著降低；與高糖組相比，HRMEC經(jīng)不同濃度的迷迭香酸處理后分布于S期細胞數(shù)量減少，G0/G1期的細胞數(shù)量明顯增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；且隨著迷迭香酸濃度的增加，阻滯于G0/G1期的細胞數(shù)量明顯增加。見圖1。

圖1 各組HRMEC周期分布

2.3 Real-time PCR檢測高糖環(huán)境下不同濃度迷迭香酸對HRMEC中VEGF mRNA水平的影響 RT-PCR結(jié)果顯示，與空白組及低糖組相比，高糖環(huán)境下HRMEC中VEGF mRNA水平明顯上升，當(dāng)經(jīng)過不同濃度的迷迭香酸處理后，其VEGF mRNA水平明顯下降，且迷迭香酸各劑量組上述指標(biāo)呈劑量依賴性降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖2。

圖2 各組HRMEC中VEGF mRNA水平

2.4 Western Blot檢測在高糖環(huán)境下不同濃度迷迭香酸對HRMEC中VEGF蛋白表達的影響 與空白組及低糖組相比，在高糖環(huán)境下HRMEC中VEGF、FOXO3a、PCNA、CDK2、Cyclin A1各蛋白相對表達水平均明顯上升（均為P<0.05）；與高糖組相比，經(jīng)不同濃度的迷迭香酸處理后HRMEC中 VEGF、FOXO3a、PCNA、CDK2、Cyclin A1各蛋白相對表達水平均顯著受到抑制，且迷迭香酸各劑量組上述蛋白水平呈劑量依賴性降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖3、4。

圖3 各組HRMEC中VEGF、FOXO3a、PCNA、CDK2、Cyclin A1蛋白水平

圖4 各組HRMEC中VEGF、FOXO3a、PCNA、CDK2、Cyclin A1蛋白電泳圖

3 討論

據(jù)流行病學(xué)統(tǒng)計，全世界范圍內(nèi)糖尿病的患病率目前已經(jīng)超過10%[10]，而在此基礎(chǔ)上發(fā)生血管并發(fā)癥的患者同樣在逐年增加，其中糖尿病視網(wǎng)膜病變是與糖尿病患者視力相關(guān)的最嚴重的特征性病變，是以血管通透性增強、微血管閉塞、組織缺氧、局部缺血為特征，刺激VEGF的形成與釋放，最終引起視網(wǎng)膜新生血管形成[11]。當(dāng)發(fā)生視網(wǎng)膜病變時，由于新生血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，易出現(xiàn)視網(wǎng)膜出血、水腫、積血等情況，如果不及時治療，50%的患者將在確診3～5年內(nèi)完全喪失視力[12]。HRMEC在高糖環(huán)境下的氧化-抗氧化系統(tǒng)會出現(xiàn)紊亂，產(chǎn)生大量的活性氧[13]，從而破壞細胞的正常功能，同時其機體炎癥指標(biāo)IL-1β、IL-6、TNF-α也會過表達[14]。目前臨床多通過藥物、激光及手術(shù)治療糖尿病視網(wǎng)膜病變，但由于其病理機制復(fù)雜，常用的治療方法難以滿足全部患者的需求，因此，目前仍迫切需要進行糖尿病視網(wǎng)膜病變的機制研究及靶向治療藥物的開發(fā)。

迷迭香酸是一種多酚酸，廣泛分布于唇形科、紫草科、葫蘆科等植物中，是多種藥材和中成藥的主要成分，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗病毒等多方面藥理學(xué)活性，且能夠在機體內(nèi)相互聯(lián)系，共同發(fā)揮治療作用[15]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，迷迭香酸能夠明顯抑制高糖環(huán)境下HRMEC的增殖活性，且隨著迷迭香酸濃度的增加，其抑制效果同樣增加。VEGF是參與視網(wǎng)膜損傷的主要標(biāo)志指標(biāo)，參與視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮連接與調(diào)節(jié)血管屏障功能[16]，本研究通過在高糖環(huán)境下培養(yǎng)HRMEC以模擬糖尿病視網(wǎng)膜病變微環(huán)境，RT-PCR結(jié)果顯示高糖環(huán)境下HRMEC中VEGF表達水平顯著上升，這與很多研究中高血糖能夠誘導(dǎo)HRMEC中VEGF過表達導(dǎo)致產(chǎn)生新生血管的結(jié)果一致[17，18]。此外，在一些關(guān)于神經(jīng)系統(tǒng)的研究中發(fā)現(xiàn)，VEGF與神經(jīng)元損害同樣具有緊密聯(lián)系[19]，可能加重糖尿病視網(wǎng)膜病變患者視力的進一步損害。FOXO3a轉(zhuǎn)錄因子已被證實具有抑制內(nèi)皮細胞增殖分化成熟、遷移及新生血管形成的作用，且FOXO3a可以對血管內(nèi)皮細胞中VEGF的表達從蛋白、mRNA和基因啟動子水平上發(fā)揮負調(diào)節(jié)作用，這一過程可能與FOXO3a通過與VEGF共同競爭轉(zhuǎn)錄激活因子FOXM1有關(guān)[20]，但當(dāng)其發(fā)生磷酸化時會失去轉(zhuǎn)錄活性[21]。在本研究中，迷迭香酸能夠降低HRMEC中VEGF與FOXO3a的表達水平，且呈劑量依賴性，這可能與迷迭香酸能夠抑制FOXO3a磷酸化，從而抑制VEGF的促血管形成功能有關(guān)。

細胞周期在各個時期由不同周期蛋白調(diào)控，其中G0/G1期向S期轉(zhuǎn)化過程中主要由Cyclin A1與CDK2結(jié)合作用于檢查點，其結(jié)合復(fù)合物具有調(diào)節(jié)DNA合成與促進細胞分裂的作用[22]。流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，高糖環(huán)境下HRMEC中周期調(diào)控蛋白Cyclin A1與CDK2的表達量顯著上升，且細胞周期多分布于S期，細胞增殖循環(huán)處于活躍狀態(tài)。PCNA在增殖細胞中于S期表達最高，G0/G1期表達量極低，因此能夠作為細胞增殖指標(biāo)[23]。在本研究中，迷迭香酸能夠顯著降低高糖環(huán)境下HRMEC中Cyclin A1、CDK2與PCNA的表達，且將細胞周期進程阻滯于G0/G1期，使細胞增殖受到抑制，從而降低新的血管生成。

綜上所述，本研究通過建立高糖環(huán)境模擬糖尿病視網(wǎng)膜病變HRMEC微環(huán)境并應(yīng)用迷迭香酸進行治療，發(fā)現(xiàn)迷迭香酸能夠通過對周期與增殖相關(guān)蛋白進行調(diào)控影響細胞周期進程，從而抑制HRMEC增殖導(dǎo)致的新生血管生成。本研究為開展糖尿病視網(wǎng)膜病變的中藥治療提供了新的思路與研究證據(jù)。