陳波洋，趙玲婕，羅運鳳，管連城，于海洋，趙 潔，張旭飛，蔣志濱，陳云志,

（1.貴州中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，貴州貴陽 550025；2.黔南州中醫(yī)院，貴州都勻 558000；3.貴州中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，貴州貴陽 550001）

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis,UC）是一種反復發(fā)作的特發(fā)性慢性結腸黏膜炎疾病，以血性腹瀉、腹痛等為典型臨床癥狀[1]。近年來，UC 發(fā)病率明顯上升且發(fā)病人群呈年輕化，已成為一種全球性疾病[2]。UC 病因病機復雜，受遺傳、環(huán)境、心理健康、免疫等因素的共同影響[3]，而免疫功能在其中發(fā)揮重要作用[4]。目前，常用5-氨基水楊酸、糖皮質(zhì)類固醇、硫嘌呤等作為UC 的治療藥物，但作用效果有限且副作用多[5]。潰瘍性結腸炎與TLR4/NF-κB 信號通路關系密切[6]。TLR4/NF-κB 信號通路是UC 發(fā)病過程中的重要介導因子，常導致UC 患者結腸炎癥持續(xù)性加重，已成為UC 患者藥物治療的靶點之一[7]。

刺梨深受貴州人民喜愛，并且與刺梨相關的產(chǎn)品也已遍布全國。刺梨根始載于《草木便方》，系薔薇科植物繅絲花Rosa roxburghiiTratt 的根，具有健胃消食，止瀉澀精的功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，刺梨根莖中的三萜類、鞣花酸類、黃酮類以及寡糖類化合物是其抗炎作用的主要有效成分，并且實驗驗證了刺梨根莖的民間抗炎功效[8]。臨床常用于治療痢疾、泄瀉等消化系統(tǒng)疾病。研究發(fā)現(xiàn)，刺梨根水煎液可促進大鼠胃潰瘍愈合[9]。此外，臨床上用鮮刺梨根水煎液治療急性細菌性痢疾有較好療效，總有效率達92.3%且無不良反應[10]。

故本課題組從TLR4/NF-κB 信號通路探討黔產(chǎn)刺梨根干預潰瘍性結腸炎大鼠的作用機制，以期為刺梨根的臨床應用提供一定的理論依據(jù)，更為了刺梨根在現(xiàn)實生活中應用的普及，使刺梨根這種價廉物美的天然營養(yǎng)植物對人類的健康作出重要貢獻。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF 級雄性SD 大鼠60 只 體質(zhì)量（230±10）g，天勤生物技術有限公司，動物合格證號SCXK（湘）2019-0014，本次動物實驗獲得貴州中醫(yī)藥大學倫理委員會批準。大鼠在溫度22～24 ℃、相對濕度40%～60%下用普通飼料喂養(yǎng)7 d 后開始實驗；黔產(chǎn)刺梨根貴州中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學方藥教研室蔣志濱副教授鑒定為薔薇科植物繅絲花Rosa roxburghiiTratt 的根；柳氮磺嘧啶（批號：E1525058） Aladdin 公司；2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS，批號：SLBX3263） Sigma 公司；白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子（TNF-α）ELISA試劑盒（批號分別為：JYM0419Ra、JYM0646Ra、JYM0635Ra） 基因美生物科技有限公司；RNA 提取試劑盒（批號：BM1144） 博美生物科技有限公司；實時熒光定量PCR 試劑盒（批號：RR047A） 寶日醫(yī)生物技術有限公司；預染蛋白Marker（批號：RM19001） ABClone 公司；ECL 發(fā)光試劑盒（批號：KF001） Affinity 公司；Immobilon-PSQ PVDF 膜（批號：ISEQ00010） Sigmaaldrich 公司；Glycine、Tris for molecular biology、SDS（批號分別為：1275GR500、1115GR500、1275GR500） Biofroxx 公司；兔多抗SLC6A4（批號分別：YO7512，G1005-1，G1001，A14782） ABclonal 公司。

QuantStudioTM3 實時熒光定量（RT-PCR）儀、TCA0096 熱循環(huán)儀、MK3 全功能酶標儀 Thermo Fisher 儀器有限公司；KZ-III-F 高速低溫組織研磨儀賽維爾生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 藥物制備 刺梨根經(jīng)蒸餾水浸泡20 min 后，武火煮沸30 min 及文火煎煮1 h，再重復以上操作一次，合并兩次煎煮液，生藥質(zhì)量濃度為8 g/mL，放置于4 ℃冰箱保存。

1.2.2 動物模型制作 將60 只SD 雄性大鼠隨機分為空白組（10 只）、模型組（50 只）。據(jù)參考文獻[11]并結合預實驗結果，造模前大鼠禁食24 h，確定大鼠直腸內(nèi)排空大便。乙醚麻醉后使用生理鹽水潤滑聚乙烯管，將TNBS 與乙醇混合溶液（100 mg/kg TNBS+0.25 mL 50%乙醇）緩慢注入距大鼠肛門處約8 cm的結腸部位，灌腸1 次。灌腸結束后，將大鼠頭部朝下倒置約5 min，并用小夾子夾住肛周皮膚，謹防TNBS 藥物流出，直至大鼠蘇醒。空白組大鼠結腸灌注0.8 mL 生理鹽水。以體重明顯下降，出現(xiàn)典型腹瀉、糞便中有暗紅色斑點且肛門可見出血作為模型制備成功的標準。

1.2.3 蘇木素-伊紅（HE）染色觀察大鼠結腸組織病理變化 隨機抽取2 只大鼠，采取HE 染色觀察各組大鼠結腸組織的病理學改變。研究表明，結腸病理顯示充血、水腫、大腸黏膜固有層淋巴細胞浸潤，中性粒細胞增多，腺體病變及潰瘍形成等系列變化，提示UC造模成功[12]。

1.2.4 動物分組、給藥與取樣 造模成功后，取空白組中8 只正常大鼠為正常組，再將40 只造模成功大鼠隨機分為5 組：UC 模型組、柳氮磺嘧啶組、刺梨根水煎液高、中、低劑量組。柳氮磺嘧啶組0.3 g/（kg·d）灌胃，刺梨根水煎液高、中、低組分別按8、4、2 g/（kg·d）劑量灌胃（給藥劑量按60 kg 成人臨床常用劑量與大鼠體表面積折算），正常組、UC 模型組均灌胃等體積生理鹽水，1 次/日，連續(xù)給藥21 d。第21 d末時禁食24 h，大鼠腹腔注射350 mg/kg 水合氯醛麻醉，并腹主動脈取血，靜置30 min，低溫離心10 min（3000 r/min），分離收集血清，?80 ℃低溫冰箱保存。取血完畢后快速收集結腸組織，截取結腸遠端部分并縱行剖開后用冰生理鹽水沖洗腸道內(nèi)容物。使用濾紙吸收多余水分，縱行一分為二，一部分用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片、HE 染色，顯微鏡下觀察結腸組織形態(tài)。一部分?80 ℃低溫冰箱保存，用于檢測結腸中Myd88、NF-κB p50、NF-κB p65、TLR4 mRNA 及蛋白表達。

1.2.5 ELISA 檢測大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平 按照ELISA 試劑盒說明書進行操作與檢測，使用酶標儀在450 nm 波長依序測量各孔的吸光度A，并根據(jù)標準曲線獲得樣品檢測目標的濃度。

1.2.6 熒光定量PCR 法檢測結腸Myd88、NF-κB p50、NF-κB p65、TLR4 mRNA 表達 根據(jù)說明書，先提取樣品總RNA，再反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司設計合成，并以ULTRAPAGE 純化，見表1。使用Thermo Scientific PikoReal 軟件分析PCR 過程各樣本的CT（Threshold cycle）值。反應結束后作熔解曲線檢測擴增產(chǎn)物的純度。通過2?△△CT法計算目的Myd88、NF-κB p50、NF-κB p65、TLR4 mRNA 的相對表達量。

1.2.7 Western blot 檢測結腸Myd88、NF-κB p50、NF-κB p65、TLR4 蛋白表達 參照說明書，將樣本取出放入2 mL 研磨管中，然后向每管加入3 mm 鋼珠及RIPA 裂解液（按照質(zhì)量比樣本:裂解液=1:10），置于高速低溫組織研磨儀內(nèi)（溫度?20 ℃，研磨4 次，每次60 s）；取出放4 ℃冰箱30 min 進行裂解，30 min后取出放入離心機（4 ℃、12000 r/min 離心、10 min）；用BCA 蛋白定量試劑盒測定離心完畢后上清液的蛋白濃度。配置相應電泳凝膠，上樣后進行電泳、轉(zhuǎn)膜，用TBST 封閉2 h，將PVDF 膜放入一抗中，（一抗?jié)舛龋篗yd88 1:1000；p50 1:1000；p65 1:2000；TLR4 1:1000；β-actin 1:100000），搖床上輕搖，4 ℃孵育過夜；用TBST 將PVDF 膜洗3 次，每次5 min；在二抗中放入PVDF 膜（稀釋濃度：1:5000）中，搖床上輕搖，室溫孵育2～3 h；用TBST 將PVDF 膜洗3 次，每次10 min，將ECL 發(fā)光液的A、B 兩種試劑等體積混勻后滴加至平鋪到曝光板的PVDF 膜上，反應1 min 后，將裝有PVDF 膜的曝光板放入化學發(fā)光凝膠成像儀的暗室中，依據(jù)信號強弱合適調(diào)整曝光時間，曝光。最后用天能GIS 機箱控制軟件V2.0曝光掃描條帶，結果以目的蛋白相對表達量表示。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件和Graph Pad Prism 8.0.1 作圖軟件進行數(shù)據(jù)分析及處理，實驗數(shù)據(jù)以表示，多組樣本均值采用單因素方差分析（ANOVA），兩兩比較采用LSD 檢驗及Dunnett’s T3 檢驗。P＜0.05 表明結果差異具有統(tǒng)計學意義，P＜0.01 表明統(tǒng)計結果具有極顯著差異。

2 結果與分析

2.1 一般狀態(tài)觀察

各組大鼠飼喂21 d，取材前一天。正常組大鼠精力旺盛，活動性高，毛發(fā)柔順有光澤，大便正常。模型組大鼠出現(xiàn)懶動，喜蜷伏角落扎堆，毛悴色夭，體質(zhì)量下降，大便稀溏或半稀溏，伴有膿血，拖尾。刺梨根水煎液低劑量組大鼠與模型組大鼠外觀、行為、精神等基本一致或看不出改善；刺梨根水煎液中劑量組大鼠外觀、行為、精神等稍有改善；刺梨根水煎液高劑量組與柳氮磺嘧啶組大鼠活動趨于正常，毛發(fā)逐漸恢復至相對有光澤，大便逐漸成形，與正常組接近。

2.2 UC 大鼠結腸組織病理變化的影響

正常組結腸黏膜各組織結構較完整，固有層內(nèi)大腸腺排列較為密集且大小相近，未見上皮細胞變性壞死或脫落。與正常組相比，模型組結腸黏膜完整性受到破壞，固有層內(nèi)部腸腺腺腔膨脹，黏膜下層或結腸全層形成明顯潰瘍，出現(xiàn)大量炎性細胞、壞死組織取代正常結構。刺梨根水煎液低劑量組結腸粘膜等較模型組基本一致或改善不明顯；刺梨根水煎液中劑量組結腸黏膜破壞稍有改善，但尚存在炎性細胞與壞死組織等；刺梨根水煎液高劑量組與柳氮磺嘧啶組兩組較模型組比，大鼠結腸黏膜各組織結構較為清晰，腸腺排列相對規(guī)則，間質(zhì)內(nèi)偶見單個淋巴細胞或中性粒細胞。見圖1。

2.3 刺梨根水煎液對UC 大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平影響

模型組較正常組而言，大鼠結腸中IL-1β、IL-6、TNF-α表達極顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。刺梨根水煎液高劑量組干預后可明顯抑制各炎癥因子的分泌；刺梨根水煎液高、中劑量組較模型組比，均可顯著降低IL-1β、IL-6 與TNF-α表達水平（P＜0.05）。刺梨根水煎液高劑量組與柳氮磺嘧啶組抑制IL-1β、IL-6、TNF-α的效果相比，差異不具有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；刺梨根水煎液中、低劑量組與柳氮磺嘧啶組抑制IL-1β、IL-6、TNF-α的效果相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見圖2。

圖2 刺梨根水煎液對UC 大鼠結腸組織IL-1β、IL-6、TNF-α 表達水平的影響（，n=8）Fig.2 Effect of Rosa roxburghii Radix aqueous decoction on the expression levels of IL-1β,IL-6 and TNF-α in the colonic tissues of UC rats (,n=8)

2.4 刺梨根水煎液對UC 模型大鼠結腸Myd88、NFκB p50、NF-κB p65、TLR4 mRNA 表達的影響

模型組較正常組比，大鼠結腸Myd88、NF-κB p50 mRNA 表達極顯著上升（P＜0.01），TLR4 mRNA表達顯著上升（P＜0.05）。刺梨根水煎液高劑量組較模型組比，大鼠結腸Myd88、NF-κB p50、TLR4 mRNA 表達均顯著下降（P＜0.05）；刺梨根水煎液中劑量組較模型組相比，大鼠結腸Myd88 mRNA 表達顯著降低（P＜0.05）；刺梨根水煎液低劑量組較模型組相比，大鼠結腸Myd88、NF-κB p50、NF-κB p65、TLR4 mRNA 表達無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。刺梨根水煎液高、中劑量組較柳氮磺嘧啶組相比，大鼠結腸Myd88、NF-κB p50、NF-κB p65、TLR4 mRNA 表達無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）；刺梨根水煎液低劑量組較柳氮磺嘧啶組相比，大鼠結腸Myd88、TLR4 mRNA 表達顯著上升（P＜0.05），NF-κB p50 mRNA 表達極顯著升高（P＜0.01），結果見圖3。

圖3 刺梨根水煎液對UC 模型大鼠結腸Myd88、NF-κB p50、NF-κB p65、TLR4 mRNA 表達的影響（，n=8）Fig.3 Effect of Rosa roxburghii Radix aqueous decoction on the expression of Myd88,NF-κB p50,NF-κB p65 and TLR4 mRNA in the colon of UC model rats（,n=8）

2.5 刺梨根水煎液對UC 模型大鼠結腸Myd88、NFκB p50、NF-κB p65、TLR4 蛋白表達的影響

模型組較正常組比，大鼠結腸Myd88 蛋白表達顯著上升（P＜0.05），NF-κB p50、NF-κB p65、TLR4蛋白表達水平均極顯著升高（P＜0.01）。刺梨根水煎液高劑量組較模型組比，大鼠結腸Myd88、NF-κB p50、NF-κB p65、TLR4 蛋白表達均極顯著降低（P＜0.01）；刺梨根水煎液中劑量組較模型組比，大鼠結腸Myd88 蛋白表達極顯著下降（P＜0.01），NF-κB p65、TLR4 蛋白表達顯著降低（P＜0.05）；刺梨根水煎液低劑量組較模型組比，各蛋白表達不具備統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。刺梨根水煎液高劑量組較柳氮磺嘧啶組比，各組蛋白不具備統(tǒng)計學差異（P＞0.05）；刺梨根水煎液中劑量組較柳氮磺嘧啶組比，NF-κB p65 蛋白表達顯著上升（P＜0.05）；刺梨根水煎液低劑量組較柳氮磺嘧啶組比，NF-κB p65、TLR4 蛋白表達極顯著升高（P＜0.01），結果見圖4。

圖4 刺梨根水煎液對UC 模型大鼠結腸Myd88、NF-κB p50、NF-κB p65、TLR4 蛋白相對表達量的影響（，n=8）Fig.4 Effect of Rosa roxburghii Radix aqueous decoction on the relative expression of Myd88,NF-κB p50,NF-κB p65 and TLR4 proteins in the colon of UC model rats (,n=8)

3 討論

UC 是一種以腸道炎癥與結腸粘膜損害為特征的常見消化系統(tǒng)疾病。TLR4/NF-κB 信號通路在UC的發(fā)病機制中發(fā)揮關鍵作用[7]。研究表明，UC 的炎癥機制被NF-κB 激活后導致腸道炎性因子異常表達[13]。從而激活UC 一系列免疫、炎癥反應，加速UC的發(fā)生發(fā)展[14]。因此，抑制NF-κB 激活作為有效的治療策略可減輕UC 患者的不良反應[15]。

Toll 樣受體（TLRs）作為模式識別受體家族的主要類型之一，主要誘導炎癥發(fā)生和建立適應性免疫[16]。其中，亞型TLR4 識別病原體相關分子模式（PAMPs）被激活后，招募骨髓樣分化蛋白（MyD88）觸發(fā)信號級聯(lián)誘導NF-κB 激活[17]。進而促進NFκB p50 與NF-κB p65 從細胞質(zhì)易位至細胞核與DNA 結合[4,18]。隨后在結腸組織及外周血中釋放大量IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥介質(zhì)，加劇UC 患者結腸及外周血的炎癥浸潤[19?20]。

本研究選用刺梨根作為實驗材料，建立UC 大鼠模型，通過PCR、Western blot、ELISA 法及結腸組織病理切片等分析刺梨根水煎液對UC 的干預作用。結果表明，造模成功后，模型組大鼠結腸及血清中各個檢測指標與正常組差異顯著（P＜0.01 或P＜0.05）。與模型組相比，刺梨根水煎液高劑量組大鼠結腸組織中Myd88、NF-κB p50、NF-κB p65 及TLR4 mRNA 蛋白表達顯著降低（P＜0.01 或P＜0.05）；說明刺梨根水煎液抑制了炎癥發(fā)生機制的相關基因及蛋白表達，有效阻止或平衡了UC 炎癥通路的激活；同時，刺梨根水煎液高劑量組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α炎癥因子表達較模型組極顯著下降（P＜0.01），表明刺梨根水煎液可改善UC 結腸組織中炎癥因子水平，能夠有效緩解UC 中的炎癥浸潤，促使UC 大鼠病變結腸康復。觀察結腸組織病理切片，刺梨根水煎液高劑量組可明顯改善病變結腸受損情況。

4 結論

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)刺梨根水煎液高劑量組可明顯改善TNBS 誘導的潰瘍性結腸炎病理損傷，發(fā)揮保護腸道的作用。其作用機制與TLR4/NF-κB 信號通路密切相關，刺梨根水煎液高劑量組使這條通路向正常狀態(tài)明顯轉(zhuǎn)變，發(fā)揮抗炎作用，減輕UC 大鼠腸道內(nèi)炎癥侵襲。本文初步闡明刺梨根水煎液對UC 大鼠抗炎的作用機制，一方面可為臨床刺梨根治療潰瘍性結腸炎提供理論依據(jù)與實驗基礎；另一方面可通過刺梨根抗腸炎普及刺梨根這種價廉物美的天然營養(yǎng)植物，使其成為人類健康的福祉。