梁云霞，謝素雅，李紅波, ，張小勇，徐 丹，莫海珍，劉振彬，胡梁斌,

（1.陜西科技大學食品與生物工程學院，陜西西安 710021；2.中糧工科（西安）國際工程有限公司，陜西西安 710082）

牦牛是一種耐低溫、耐力強的珍稀畜種資源，主要生活在我國青藏高原等空氣稀薄的高海拔地區(qū)。牦牛是唯一能在青藏高原及其毗鄰的高寒牧區(qū)繁衍的牛亞科動物，有“高原之舟”和“全能家畜”的美譽[1?2]。我國是世界上牦牛飼養(yǎng)最多的國家。據(jù)統(tǒng)計，根據(jù)國家肉牛牦牛產(chǎn)業(yè)技術體系測算，2020 年，全國屠宰肉牛頭數(shù)約2920 萬頭，胴體總產(chǎn)量約為740 萬t，凈肉產(chǎn)量約637 萬t[3]。牦牛骨作為牦牛肉加工過程中產(chǎn)生的主要副產(chǎn)物，其營養(yǎng)豐富，含有豐富的膠原蛋白、多肽、多糖和脂肪等營養(yǎng)物質(zhì)[4?5]。

而牦牛骨作為可食性副產(chǎn)物未被有效利用。其中多肽和多糖綜合利用程度較高[6?8]，近年來對牦牛骨的利用多集中在制備骨湯、骨粉、骨肽、硫酸軟骨素多糖等提取制備及微量元素上[9?12],但對其脂肪酸的研究鮮見報道[13?14]。脂肪酸作為骨代謝中不可缺少的成分，對維持骨健康具有重要的作用[15?16]。脂肪酸與骨代謝和相關的骨疾病密切相關，例如脂肪酸可降低心血管等疾病的風險，脂肪酸是治療和預防代謝性骨病的潛在治療劑和營養(yǎng)劑[17?20]。而在牦牛骨加工中，工藝上脫脂是第一道工序，脂肪作為畜禽骨加工產(chǎn)業(yè)中的廢棄物和污染物，常常被丟棄。本文通過提取牦牛骨中的脂質(zhì)，測定其理化性質(zhì)，分析其脂質(zhì)組成，為提高牦牛骨的利用率，實現(xiàn)高值化利用打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牦牛骨（牦牛腿骨） 源自于食品公司生產(chǎn)所用廢料；Car 標準品（純度≥99.9%）、SM 標準品（純度≥99.9%）、PC 標準品（純度≥99.9%）和TAG 標準品（純度≥99.9%） 均購自美國Avanti 公司；2,6-二叔丁基對甲酚、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氯仿、甲醇、乙醇、乙醚、正己烷、異丙醇、乙腈、酚酞 上海麥克林生化有限公司；1%硫酸甲醇溶液、飽和NaCl 溶液、0.1%甲酸、0.01 mol/L 乙酸銨、鉻酸洗液、三氯甲烷乙酸混合溶液、1%淀粉指示劑、0.1 mol/L 硫代硫酸鈉標準溶液、碘化鉀飽和溶液、氫氧化鉀、鹽酸標準滴定溶液等 均為實驗室配制溶液；所有有機溶劑均為國產(chǎn)分析純。

Agilent 7000D 三重四極桿GC/MS 儀 安捷倫科技（中國）有限公司；TSQ Quantiva 三四極質(zhì)譜儀賽默飛世爾科技有限公司；LC-2800 RoHS2.0 高效液相色譜儀（HPLC） 佛山市捷特精密儀器有限公司；RE100-Pro 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 大龍興創(chuàng)實驗儀器（北京）有限公司；892 型油脂氧化穩(wěn)定分析儀 瑞士萬通中國有限公司；FS 3310 型真空抽濾器 鄭州市亞榮儀器有限公司；MD 200-1 型氮吹儀 杭州奧盛儀器有限公司；KQ5200DE 型數(shù)控超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司；FW-100 D 型高速萬能碎骨機 天津鑫博得儀器有限公司；JA 2003 N 型分析天平 上海佑科儀器儀表有限公司；HH-W 21-600型恒溫水浴鍋 鄭州南北儀器設備有限公司；納米噴流離子源 艾德威爾生物科學股份公司；SHB-III 型循環(huán)水式多用真空泵 遼寧賽亞斯科技有限公司；VRD-8 型雙級旋片式真空泵 遼寧賽亞斯科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品預處理 將牦牛腿骨剔除表面的肉等雜質(zhì)，粉碎成粒徑1 mm 的顆粒狀待用。

1.2.2 油脂提取 油脂的提取按照Folch 的方法[21]稍作修改。樣品粉碎之后稱重，按照樣品：溶劑為1:10 或1:15（根據(jù)樣品的量進行調(diào)節(jié)），溶劑（氯仿:甲醇:水=2:1:0.75），加入0.005%的2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）抗氧化，30 ℃，500 W 超聲波輔助萃取20 min，真空抽濾后分液收集下層，棄去上層，下層旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑得到油脂，每個樣品重復三次萃取，旋蒸后還殘存的有機溶劑可用氮吹法除去，得到的油脂裝樣后低溫保存測樣。

1.2.3 脂肪酸甲酯化 取20 μL 1.2.2 的樣品至試管中，加入1.5 mL 的1%硫酸甲醇溶液，80 ℃水浴1 h并且不時搖晃，水浴后加入1 mL 飽和NaCl 溶液，1 mL 去離子水，2 mL 色譜純正己烷，靜置分層后收集上層有機相低溫保存?20 ℃下進行質(zhì)譜分析。

1.2.4 脂質(zhì)分析 在本研究中使用三四極質(zhì)譜儀，配備了自動納米噴流離子源，并在Xcalibur 系統(tǒng)軟件下運行，根據(jù)脂質(zhì)組學原理[22]，采用多維質(zhì)譜鳥槍法脂質(zhì)組學（MDMS-SL）對不同種類和個體的脂質(zhì)進行鑒定和定量[23?24]。

FAMEs（脂肪酸甲酯）的分析采用GC-MS 系統(tǒng)（Agilent 7000 D 三重四極桿 GC/MS），配以安捷倫DB-23 色譜柱（30 mm×0.25 mm 內(nèi)徑，0.25 μm 膜厚）。在全掃描模式下（m/z 50～500），所有測量都使用以下程序進行：初始溫度130 ℃保持1 min，然后升高到230 ℃，坡度為5 ℃/min。最終溫度230 ℃維持5 min，總運行時間為26 min。將1.2.3 脂肪酸甲酯化后的樣品與0.01 mmol/mL 標準品（Car、SM、PC 和TAG）溶液按照10:1 的比例混合后吸取1 μL 進樣，通過自動進樣器在1:20 的分裂模式下進行，將質(zhì)譜所得原始數(shù)據(jù)用Xcalibur 軟件處理，并用內(nèi)標法來進行定性和定量。

1.2.5 物理化學指標測定 用IUPAC 法（2.101、2.102、2.202、2.501）[25]分別測定牦牛骨油脂的密度、折射率、皂化值和過氧化值。油的顏色根據(jù)AOCS官方方法[26]測定。碘值、酸價、熔點采用GB/T 5532-2008、GB/T 5009.229-2016 和GB/T 12766-2008 來進行測定。

1.2.6 生育酚成分的測定 油中的生育酚（α-生育酚、α-三烯酚、γ-三烯酚）含量根據(jù)以前的報告[27]進行了一些修改。采用HPLC 高效液相色譜和熒光檢測器進行分析：色譜柱Hypersil ODS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為正己烷/異丙醚（99/1，v/v）；流速0.7 mL/min；柱溫設置為40 ℃，激發(fā)發(fā)射波長分別設置在298 和325 nm。將油以30 mg/mL 溶解于正己烷中，用正己烷/異丙醚（99/1，v/v）以0.8 mL/min溶劑洗脫，進樣量20 μL。按照標準曲線測定生育酚的絕對含量：α-生育酚、α-三烯酚、γ-三烯酚在0.015～1.7 μg 與對應的峰面積作圖，呈良好的線性關系，相關系數(shù)在0.9993～0.9998 之間，最低檢測限（3 倍噪音S/N）3.5×10?5μg/g。

1.2.7 油脂氧化穩(wěn)定性的測定 油的氧化穩(wěn)定性根據(jù)報道的方法[28]用油脂氧化穩(wěn)定分析儀進行測定；油（5 g）在110 ℃（空氣流量20 L/h）下氧化，感應時間自動記錄。

1.3 數(shù)據(jù)分析

本實驗所有數(shù)據(jù)均重復三次，數(shù)據(jù)運用利用EXCEL 2003、Origin 8.5 來繪制圖形，SPSS 軟件進行方差及顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛骨脂質(zhì)的脂肪酸組成

對牦牛骨脂質(zhì)進行GC-MS 分析，結(jié)果如表1 所示。牦牛骨中檢出20 種脂肪酸，遠遠高于文獻所報道的羊骨和雞骨的脂肪酸種類的7 種和17 種[29?30]。牦牛骨脂質(zhì)脂肪酸種類豐富，其中包括癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、油酸、接骨木酸等。其C 原子主要在11～21 之間。牦牛骨脂質(zhì)不但含有驢骨骨油中所缺少的亞油酸，脂肪酸種類也比驢骨骨油多[31]，而且還有雞骨和羊骨[29?30]中沒有的癸酸，且癸酸含量為0.07%。研究顯示，癸酸在體內(nèi)起中性作用，它們會增加膽固醇的濃度，但同時也會調(diào)節(jié)LDL（低密度脂蛋白）代謝[32]。相關研究表明，脂肪酸與人體健康息息相關，不飽和脂肪酸不但具有抑制血栓形成、降低血脂、防止心肌缺血、抑制動脈粥樣硬化等作用，而且對心腦血管疾病防治、抗癌、降膽固醇、促生長因子、免疫調(diào)節(jié)和防治糖尿病有積極作用。除此之外，脂肪酸對骨骼生長發(fā)育有促進的作用[33]。研究表明，n-3 PUFAs 與兒童的生長發(fā)育密切相關，PUFA 在骨質(zhì)疏松方面對骨健康存在重要影響，多不飽和脂肪酸（如花生四烯酸）可以通過AA（含氮化合物）代謝通路促進骨折愈合[34?35]。

牦牛骨脂質(zhì)脂肪酸中，SFA（飽和脂肪酸）含量占脂肪酸總量的41.75%。FA n:1（單不飽和脂肪酸）為53.01%，PUFA（多不飽和脂肪酸）1.46%，其他為3.79%。其中，飽和脂肪酸有癸酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、月桂酸、硬脂酸、花生酸等，不飽和脂肪酸有油酸、棕櫚酸等。飽和脂肪酸中，硬脂酸含量較高，為18.51%，其含量高于羊骨油中的硬脂酸含量15.6%[29]。不飽和脂肪酸中，棕櫚酸和油酸含量較高，分別為20.38%和49.02%，且有研究顯示棕櫚酸酯對促進嬰幼兒體內(nèi)脂肪酸和礦物類營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，提高骨骼生長速度及骨礦物質(zhì)含量及密度，促進腸道益生菌的生長，減少嬰兒啼哭，促進大腦發(fā)育方面有積極作用[36]。因此，牦牛骨脂質(zhì)脂肪酸對維持骨健康具有重要的作用。

2.2 牦牛骨脂質(zhì)組學定量分析結(jié)果

對牦牛骨脂質(zhì)進行脂質(zhì)組學分析，從表2～表5可以看出在負離子模式下，牦牛骨油脂中共檢測出4 種脂質(zhì)：Car（乙酰左旋肉堿）、SM（鞘磷脂）、PC（磷脂酰膽堿）、TAG（三脂酰甘油及中性脂肪）。其中Car 19 種、SM 17 種、PC 36 種、TAG 39 種。Car 主要集中在m/z 368～512 區(qū)域，SM 主要集中在m/z 681～821 區(qū)域，PC 主要集中在m/z 710～846 區(qū)域，TAG 主要集中在m/z 807～919 區(qū)域。從表中可以看出，牦牛骨脂質(zhì)中Car（18:0）、SM（N-16:0）、PC（D-16:0/18:1）、TAG（C52:2/C53:9）含量最高。其中Car 和SM 是兩種磷脂，他們的2 條脂肪酸鏈sn-1/sn-2 位多數(shù)由18:0 和18:1 組成，所有的脂肪?；溣?4～24 個碳，每個鏈上有0～5 個雙鍵。從圖1 可以看出Car（乙酰左旋肉堿）、SM（鞘磷脂）、PC（磷脂酰膽堿）、TAG（三脂酰甘油及中性脂肪）的含量分別為1.47、51.59、70.16 nmol/g 和31.13 nmol/g 。這四種含量最高的是PC，其次是SM、TAG 和Car。

表2 乙酰左旋肉堿分子種類、質(zhì)荷比、含量Table 2 Car molecular species,mass-to-charge ratio and content

表3 鞘磷脂分子種類、質(zhì)荷比、含量Table 3 SM molecular species,mass-to-charge ratio and content

表4 磷脂酰膽堿分子種類、質(zhì)荷比、含量Table 4 PC molecules species,mass-to-charge ratio and content

表5 甘油三酯及中性脂肪分子種類、質(zhì)荷比、含量Table 5 TAG molecular species,mass-to-charge ratio and content

圖1 牦牛骨脂質(zhì)Car、SM、PC、TAG 的含量Fig.1 The content of Car,SM,PC,TAG in yak bone lipid

2.3 理化指標的測定

牦牛骨的理化指標結(jié)果見表6。用IUPAC 法測定了牦牛腿骨的理化指標，結(jié)果表明：牦牛腿骨的皂化值191.56 mg KOH/g，在185～200 mg KOH/g的范圍之內(nèi)，說明牦牛腿骨的脂肪酸在C16～C18 的范圍內(nèi)。從氧化穩(wěn)定性和酸價來看，牦牛腿骨的酸價為2.03 mg KOH/g，說明腿骨的油脂的脂肪酸穩(wěn)定性較好。而牦牛腿骨的碘值為26.45 g/100 g，說明牦牛腿骨的不飽和脂肪酸較多。牦牛腿骨的熔點較高，過氧化值和折射率分別為5.26 mmol/kg 和1.4253%，由于油脂色澤過暗，未能檢出，需要進一步精煉。

表6 牦牛骨理化性質(zhì)Table 6 Physical and chemical properties of yak bone

2.4 牦牛骨油脂中的酚類化合物

牦牛骨油脂的酚類化合物含量見表7。從牦牛腿骨中檢出了兩種VE成分：α-三烯酚和γ-三烯酚，其含量分別為1.75 μg/g 和3.6 μg/g。已有研究表明，生育三烯酚可通過激活Wnt/β-catenin 信號減少激素誘導骨質(zhì)疏松大鼠骨量流失，提高骨密度、骨微觀結(jié)構和骨強度[37]。生育酚可治療骨壞死，對骨健康有益[38]。

表7 牦牛骨油脂中酚類化合物的含量Table 7 Content of phenolic compounds in yak bone grease

2.5 油脂的氧化穩(wěn)定性

油脂氧化受氧、水、光、熱、微生物等作用，會逐漸水解或氧化而變質(zhì)酸敗，使中性脂肪分解為甘油和脂肪酸，或使脂肪酸中不飽和鏈斷開形成過氧化物，再次分解而產(chǎn)生有害物質(zhì)。通過測定誘導時間的長短可以了解油脂氧化穩(wěn)定性的大小，誘導期越長表明油脂氧化穩(wěn)定性好，反之，油脂氧化穩(wěn)定性越差。油脂的氧化曲線如圖2 所示，牦牛骨油脂的誘導時間為5.56 h。孫曙慶[39]研究的在110 ℃下豬油的誘導時間為2.5 h，花生油、菜籽油和大豆油的氧化誘導時間分別為4.0、3.7 h 和3.5 h。而牦牛骨的氧化誘導時間明顯高于這些動物油脂和植物油脂。因此，牦牛骨的油脂氧化穩(wěn)定性比較好，具有較好的抗氧化效果。

圖2 油脂氧化曲線Fig.2 Oil oxidation curve

3 結(jié)論

本實驗對牦牛腿骨脂質(zhì)進行提取，利用GCMS 進行脂質(zhì)組學分析并測定其理化指標。脂質(zhì)組學分析顯示，共檢出20 種脂肪酸，其中SFA（飽和脂肪酸）含量占脂肪酸總量的41.75%，F(xiàn)A n:1 為53.01%，PUFA 1.46%，其他為3.79%。在負離子模式下共檢測出4 種脂質(zhì)：Car、SM、PC 和TAG，其中Car 19 種、SM 17 種、PC 36 種、TAG 39 種。這四種含量依次是PC＞SM＞TAG＞Car。

理化指標結(jié)果表明，牦牛腿骨的脂肪酸在C16～C18的范圍內(nèi)，油脂的脂肪酸氧化誘導時間為5.56 h，穩(wěn)定性較高、抗氧化效果較強且不飽和脂肪酸較多。由于油脂色澤過暗，未能檢出。從牦牛腿骨中檢出了兩種物質(zhì)：α-三烯酚和γ-三烯酚。牦牛骨脂肪中脂肪酸含量豐富，其含有其他動物骨中所沒有的癸酸，還有骨健康有益的棕櫚酸等。而脂肪酸被認為可以維持骨健康，因此，牦牛骨中的脂質(zhì)可以作為維護骨健康的營養(yǎng)補充劑，從而為實現(xiàn)其高值化利用打下基礎。