黃艷艷, 林書(shū)典, 詹 鋒, 肖 璐, 詹宇威, 莫碧瑤, 韓葉光

(海南省人民醫(yī)院/海南醫(yī)學(xué)院附屬海南醫(yī)院, 1. 風(fēng)濕免疫科, 2. 檢驗(yàn)科, 海南 ?？? 570311)

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種慢性自身免疫性疾病，主要侵犯機(jī)體的手足關(guān)節(jié)。RA以T細(xì)胞浸潤(rùn)滑膜、持續(xù)的炎性反應(yīng)、進(jìn)行性軟骨退化及骨侵蝕為主要病理改變，可導(dǎo)致患者關(guān)節(jié)畸形和功能障礙，甚至增大心血管事件風(fēng)險(xiǎn)，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量[1-2]。RA病因復(fù)雜，至今發(fā)病機(jī)制仍不明確，且臨床上僅能對(duì)癥治療，大部分患者無(wú)法徹底治愈[3]。因此，進(jìn)一步闡明RA發(fā)病機(jī)制，尋找新的有效治療靶點(diǎn)，仍是臨床研究者迫切需要解決的問(wèn)題?？扇苄猿绦蛐运劳鍪荏w-1(sPD-1)是程序性死亡受體-1(PD-1)的可溶形式，可阻斷PD-1/程序性死亡配體-1(PD-L1)負(fù)性信號(hào)，促進(jìn)T細(xì)胞的活化增殖，強(qiáng)化免疫應(yīng)答，刺激炎癥因子分泌，在自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用[4-5]。干擾素調(diào)節(jié)因子4(IRF4)是誘導(dǎo)、調(diào)節(jié)干擾素的轉(zhuǎn)錄因子，在T細(xì)胞分化成熟調(diào)節(jié)中發(fā)揮不可或缺的作用，參與多種自身免疫性疾病的發(fā)病環(huán)節(jié)[6-7]。sPD-1、IRF4均參與了RA的發(fā)生，但其與RA疾病活動(dòng)性、免疫炎癥的關(guān)系尚不明確[8-9]。本研究檢測(cè)不同受試者血清中sPD-1、IRF4表達(dá)水平，初步探討sPD-1、IRF4與RA患者疾病活動(dòng)性及體內(nèi)炎癥反應(yīng)的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020年10月—2021年9月接受治療的RA患者100例(RA組)為研究對(duì)象，其中緩解期患者(RA緩解組)50例，活動(dòng)期患者(RA活動(dòng)組)50例。納入標(biāo)準(zhǔn): RA診斷依據(jù)《2018年中國(guó)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎診療指南》[10], 依據(jù)28個(gè)關(guān)節(jié)疾病活動(dòng)度(DAS28)評(píng)分[11]對(duì)患者RA疾病活動(dòng)性進(jìn)行分組，緩解期為DAS28評(píng)分<2.8分，活動(dòng)期為DAS28評(píng)分≥2.8分。排除標(biāo)準(zhǔn): ① 感染、外傷等因素導(dǎo)致的關(guān)節(jié)腫痛者; ② 合并惡性腫瘤、糖尿病、血液系統(tǒng)疾病、重要臟器功能不全、其他自身免疫性疾病及風(fēng)濕性疾病者; ③ 依從性差者; ④ 年齡<18歲者。選取同期接受治療的骨關(guān)節(jié)炎(OA)患者50例為OA組，排除有過(guò)敏史、自身免疫性疾病史者，選擇同期進(jìn)行體檢的健康者50例為對(duì)照組。收集所有入選者性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)等一般資料。所有入選者對(duì)本研究知情同意并簽署知情同意書(shū)，本研究得到醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào)202008-22)。

1.2 試劑與儀器

人sPD-1、白細(xì)胞介素-17(IL-17)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒(貨號(hào)CD-102163、CD-100414)購(gòu)自武漢純度生物科技有限公司; 人IRF4 ELISA試劑盒(貨號(hào)EH9468)購(gòu)于武漢菲恩生物科技有限公司; 人白細(xì)胞介素-4(IL-4)、干擾素γ(IFN-γ)ELISA試劑盒(貨號(hào)SEKH-0011、SEKH-0046)購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司。MODEL550酶標(biāo)儀為美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.3 ELISA法檢測(cè)受試者血清sPD-1、IRF4、IL-4、IL-17、IFN-γ表達(dá)水平

RA患者、OA患者入院第2天，健康者體檢當(dāng)天均抽取清晨空腹靜脈血5 mL, 3 000轉(zhuǎn)/min、4 ℃離心處理10 min, 結(jié)束后取上清液，分裝后置于-80 ℃冰箱保存待測(cè)。血清樣本于冰上融化，采用人sPD-1、IRF4、IL-4、IL-17、IFN-γ ELISA試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，在酶標(biāo)儀上測(cè)得光密度(OD)值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算血清sPD-1、IRF4、IL-4、IL-17、IFN-γ表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 對(duì)照組、OA組和RA組受試者一般資料比較

對(duì)照組、OA組和RA組受試者性別、年齡、BMI比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05), 具有可比性，見(jiàn)表1。

表1 對(duì)照組、OA組和RA組受試者一般資料比較

2.2 對(duì)照組、OA組和RA組受試者血清sPD-1、IRF4水平比較

對(duì)照組、OA組和RA組受試者血清sPD-1、IRF4水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組比較, OA組和RA組受試者血清sPD-1、IRF4水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與OA組比較, RA組受試者血清sPD-1、IRF4水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 對(duì)照組、OA組和RA組受試者血清sPD-1、IRF4水平比較 ng/mL

2.3 RA緩解組和RA活動(dòng)組RA患者血清sPD-1、IRF4水平比較

與RA緩解組比較, RA活動(dòng)組RA患者血清sPD-1、IRF4水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見(jiàn)表3。

表3 RA緩解組和RA活動(dòng)組患者血清sPD-1、IRF4水平比較 ng/mL

2.4 對(duì)照組、OA組和RA組受試者血清IL-4、IL-17、IFN-γ水平比較

對(duì)照組、OA組和RA組受試者血清IL-4、IL-17、IFN-γ水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組比較, OA組和RA組受試者血清IL-4、IL-17、IFN-γ水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與OA組比較, RA組受試者血清IL-4、IL-17、IFN-γ水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見(jiàn)表4。

表4 對(duì)照組、OA組和RA組受試者血清IL-4、IL-17、IFN-γ水平比較 pg/mL

2.5 RA患者血清sPD-1、IRF4水平與血清IL-4、IL-17、IFN-γ水平的相關(guān)性分析

相關(guān)性分析結(jié)果顯示, RA患者血清sPD-1水平與血清IL-4、IL-17、IFN-γ水平均呈正相關(guān)(r=0.432、0.426、0.515,P<0.05), RA患者血清IRF4水平與血清IL-4、IL-17、IFN-γ水平均呈正相關(guān)(r=0.480、0.536、0.526,P<0.05), 見(jiàn)圖1。

圖1 RA患者血清sPD-1、IRF4水平與血清IL-4、IL-17、IFN-γ水平的相關(guān)性分析圖

3 討 論

RA是一種以滑膜炎癥及關(guān)節(jié)軟骨、骨質(zhì)侵蝕性破壞為主要特征的自身免疫性疾病，會(huì)引起患者關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、僵硬和功能喪失[12]。RA作為特發(fā)性的自身免疫性、慢性炎癥疾病，自身免疫紊亂及炎癥反應(yīng)異常在其發(fā)病機(jī)制中扮演重要角色[1]。T細(xì)胞異?；罨閷?dǎo)的免疫系統(tǒng)紊亂在RA進(jìn)展中起關(guān)鍵作用, T細(xì)胞異常激活后，會(huì)分泌IL-4、IL-17、IFN-γ等各種炎癥細(xì)胞因子，加重RA滑膜炎病情。本研究顯示, RA患者血清IL-4、IL-17、IFN-γ水平均高于OA患者、健康者，表明T細(xì)胞活化分泌IL-4、IL-17、IFN-γ參與RA發(fā)生。研究[13]發(fā)現(xiàn)，T細(xì)胞活化過(guò)程需要抗原刺激提供的第一信號(hào)和協(xié)同刺激分子提供的第二信號(hào)刺激，如果缺失協(xié)同刺激分子的相互作用傳遞，會(huì)導(dǎo)致T細(xì)胞無(wú)反應(yīng)性或功能失活。因此，對(duì)T細(xì)胞增殖活化有關(guān)的因子展開(kāi)研究有助于闡明RA發(fā)病機(jī)制，找到新的有效治療靶點(diǎn)。

在免疫調(diào)節(jié)中, PD-1/PD-L1信號(hào)通路發(fā)揮著負(fù)性調(diào)節(jié)作用, PD-1可結(jié)合PD-L1抑制正性共刺激分子的表達(dá)，從而阻止T細(xì)胞的異?；罨?、增殖，減少I(mǎi)L-4、IL-17、IFN-γ等炎癥因子的分泌[14]。武加標(biāo)等[15]研究表明, PD-1/PD-L1信號(hào)通路可通過(guò)調(diào)控T細(xì)胞參與RA的發(fā)生，而sPD-1作為PD-1的可溶性型形式，具有阻斷PD-1/PD-L1負(fù)性信號(hào)通路的生物學(xué)功能，可能調(diào)控IL-4、IL-17、IFN-γ的分泌。郭艷華等[16]發(fā)現(xiàn), sPD-1在RA患者血清中呈異常高表達(dá)，并與病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn), RA患者血清sPD-1水平較OA患者、健康者高，活動(dòng)期RA患者血清sPD-1水平較緩解期RA患者高，表明sPD-1不僅參與RA的發(fā)病過(guò)程，還與RA病情進(jìn)展有關(guān)。此外, RA患者血清sPD-1水平與血清IL-4、IL-17、IFN-γ水平均呈正相關(guān)，表明sPD-1表達(dá)與T細(xì)胞活化分泌IL-4、IL-17、IFN-γ關(guān)系密切，推測(cè)sPD-1可能通過(guò)阻斷PD-1/PD-L1通路導(dǎo)致RA患者T細(xì)胞活化信號(hào)不斷增強(qiáng)，最終導(dǎo)致自身免疫紊亂，并不斷分泌IL-4、IL-17、IFN-γ等細(xì)胞因子，加重RA病情。

在T細(xì)胞主導(dǎo)的免疫反應(yīng)中, IRF家族成員IRF4可作為非特異的轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)節(jié)Treg/Th17、Th1/Th2細(xì)胞的分化和發(fā)育，進(jìn)而影響IL-4、IL-17、IFN-γ等細(xì)胞因子的分泌過(guò)程[17]。郭釗林[18]研究顯示, IRF4在自身免疫性疾病系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血清中顯著增高，且與疾病活動(dòng)性指數(shù)相關(guān)。本研究顯示, RA患者血清IRF4水平較OA患者、健康者均升高，且活動(dòng)期RA患者血清IRF4水平較緩解期RA患者升高，表明IRF4參與了RA的發(fā)生，并與RA疾病活動(dòng)性有關(guān)。相關(guān)性分析表明, RA患者血清IRF4水平與血清IL-4、IL-17、IFN-γ水平呈正相關(guān)，表明IRF4與免疫炎癥反應(yīng)關(guān)系密切，鑒于IRF4與T細(xì)胞主導(dǎo)的免疫反應(yīng)的關(guān)系，推測(cè)IRF4可能增強(qiáng)了RA患者的T細(xì)胞活化信號(hào)，刺激其不斷向Treg/Th17、Th1/Th2分化，進(jìn)而引起IL-4、IL-17、IFN-γ分泌的增加，導(dǎo)致免疫炎癥反應(yīng)異常，從而參與RA的發(fā)生和發(fā)展。

綜上所述，sPD-1、IRF4在RA患者血清中均顯著升高，在不同疾病活動(dòng)性RA患者血清中呈差異表達(dá)，與患者體內(nèi)免疫炎癥反應(yīng)異常密切相關(guān)，參與RA的發(fā)生和發(fā)展，有潛力成為RA的有效治療靶點(diǎn)。