王子豪, 黃 瑤, 2, 孔桂美

(1. 揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院, 江蘇 揚(yáng)州, 225000; 2. 江蘇省揚(yáng)州市疾病預(yù)防控制中心, 江蘇 揚(yáng)州, 225000)

新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)的迅速傳播導(dǎo)致了新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)在全球范圍內(nèi)的大流行。因此，開發(fā)快速而高特異性的病毒檢測方法以便快速識別和隔離感染患者對控制SARS-CoV-2的傳播至關(guān)重要，是全球疫情防控的關(guān)鍵。目前，檢測SARS-CoV-2感染的方法包括病原學(xué)檢測、核酸檢測和血清學(xué)檢測。核酸檢測，尤其是實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測方法具有諸多優(yōu)勢，是目前檢測SARS-CoV-2感染的首選方法。血清學(xué)檢測方法主要針對血液中病毒的特異性抗體進(jìn)行檢測，與核酸檢測有著較好的互補(bǔ)性。本研究對目前SARS-CoV-2檢測方法的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為臨床醫(yī)生及科研工作者提供參考。

1 病原學(xué)檢測

病原學(xué)檢測是直接檢測機(jī)體內(nèi)病毒感染情況的方法，是檢測SARS-CoV-2的金標(biāo)準(zhǔn)。病毒的分離、培養(yǎng)、鑒定及電鏡觀察是目前主要使用的病原學(xué)檢測方法。LIU C等[1]使用冷凍電子顯微鏡首次觀察到了SARS-CoV-2經(jīng)滅活后的真實(shí)形貌，病毒顆粒近似球形或中度多形性，刺突向外呈釘子狀，病毒體嵌入包膜內(nèi); 同時(shí)，對融合后尖峰結(jié)構(gòu)的研究則表明了融合后的刺突是柔性的，并且相對于病毒膜具有有限的可變方向。非常關(guān)鍵的收獲是捕捉到了病毒即將與細(xì)胞發(fā)生融合這一重要的中間狀態(tài)，這為SARS-CoV-2的識別、鑒定和臨床相關(guān)研究提供了重要的超微影像基礎(chǔ)。ZHU N等[2]從3份支氣管肺泡灌洗樣本中分離獲得病毒毒株; 同時(shí)，體外培養(yǎng)表明接種人氣道上皮細(xì)胞96 h后即可觀察到細(xì)胞病變作用，直到接種后6 d, 在Vero E6和Huh-7細(xì)胞系中仍未觀察到特異性的細(xì)胞病變作用。雖然病原學(xué)檢測方法是檢測SARS-CoV-2的金標(biāo)準(zhǔn)，但與其他檢測技術(shù)相比，其對實(shí)驗(yàn)室環(huán)境要求極為苛刻，必須在P3級及以上的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，同時(shí)操作過程繁瑣、耗時(shí)且難度高，難以滿足現(xiàn)階段SARS-CoV-2的檢測需求，只適用于基礎(chǔ)科學(xué)研究。

2 核酸檢測

機(jī)體感染SARS-CoV-2后會產(chǎn)生大量RNA, 而免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的抗體往往出現(xiàn)較晚，因此核酸檢測仍是目前最主要的檢測方法。核酸檢測的主要樣本來源包括感染者的鼻咽拭子、深部痰、下呼吸道分泌物、肺泡灌洗液等。

2.1 基因測序技術(shù)

隨著高通量測序技術(shù)(NGS)的迅猛發(fā)展，其在病原檢測中展現(xiàn)出一定的技術(shù)優(yōu)勢，可在第一時(shí)間獲取新發(fā)未知病毒的基因組序列信息，為突發(fā)疫情的防控和后續(xù)研究提供了技術(shù)支撐。NGS可一次性地檢測包括SARS-CoV-2在內(nèi)的所有可能感染的病原微生物基因序列[3], 為獲得多重感染或繼發(fā)感染的相關(guān)病原信息提供支持。CHEN L J等[4]利用宏基因組測序(mNGS)快速檢測出患者支氣管肺泡灌洗液(BALF)標(biāo)本中的SARS-CoV-2; 進(jìn)一步的系統(tǒng)發(fā)育分析表明, SARS-CoV-2與蝙蝠冠狀病毒毒株bat-SL-CoVZC45、bat-SL-CoVZXC21具有87.9%的核苷酸同源性。WANG M等[5]結(jié)合病毒靶向擴(kuò)增和納米孔測序長讀、實(shí)時(shí)的優(yōu)勢，創(chuàng)造性地開發(fā)了納米孔靶向測序(NTS)技術(shù)，僅需6～10 h即可同時(shí)檢測包括SARS-CoV-2等多種常見的呼吸道病毒，有助于快速判斷SARS-CoV-2患者是否發(fā)生多重感染，對臨床診斷及治療具有重大的意義。同時(shí), NTS還可以檢測病毒突變，用于SARS-CoV-2的分型，為流行病學(xué)分析提供支持。雖然NGS具有高準(zhǔn)確性、高靈敏度等優(yōu)勢，但鑒于其檢測儀器昂貴、檢測結(jié)果需要專業(yè)人士來解讀、檢測周期長等問題，難以進(jìn)行大規(guī)模的快速篩查。

2.2 qRT-PCR技術(shù)

qRT-PCR技術(shù)是目前臨床檢測SARS-CoV-2的主要手段。qRT-PCR技術(shù)是從樣本中分離出病毒RNA, 利用熒光信號對逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)的進(jìn)程進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析。目前, SARS-CoV-2基因組中的ORF1ab基因和N基因是qRT-PCR的主要靶向。CHU D K W等[6]開發(fā)了2種單步qRT-PCR, 用于檢測SARS-CoV-2基因組中的ORF1ab基因和N基因，通過對COVID-19患者的臨床樣本進(jìn)行進(jìn)一步系統(tǒng)性研究，證實(shí)了該方法在臨床診斷中的價(jià)值，并發(fā)現(xiàn)了N基因RT-PCR檢測對臨床樣本中的SARS-CoV-2 RNA更為敏感，約是ORF1ab基因測定的10倍。依據(jù)檢測性能,N基因RT-PCR被建議用作篩查測定，而ORF1ab基因測定則推薦作為確診測定。CORMAN V M等[7]在缺乏SARS-CoV-2分離株的條件下，利用公開的SARS-CoV-2序列，開發(fā)了一種針對N、E和RdRP基因的單步RT-PCR試劑盒，其中RdRP基因測定表現(xiàn)出最高的靈敏度。CHAN J F W等[8]開發(fā)了針對RdRp/Hel不同區(qū)域的新型檢測方法，對于不同類型的臨床樣本均顯示出較之前開發(fā)的RdRp-P2基因測定法更高的靈敏度。更重要的是,RdRp/Hel檢測方法與其他常見呼吸道病原體無交叉反應(yīng)，具有高度特異度。

盡管qRT-PCR技術(shù)具有成本較低、操作簡便、快速、高靈敏度和高特異度等特點(diǎn)，但仍有缺點(diǎn)，例如采樣方式的不規(guī)范以及感染早期時(shí)病毒載量低于qRT-PCR檢測閾值等均會導(dǎo)致假陰性結(jié)果，因而在后續(xù)的檢測工作中需規(guī)范樣本采集，多部位聯(lián)合采集，以減少假陰性結(jié)果的發(fā)生[9]。

2.3 微流控芯片技術(shù)

微流體技術(shù)將樣品制備、反應(yīng)、分離和檢測等基本操作單元集成到微米級芯片中，自動完成整個(gè)分析過程。即時(shí)檢驗(yàn)(POCT)也稱為快速現(xiàn)場檢驗(yàn)或床頭檢驗(yàn)，不同于傳統(tǒng)的檢驗(yàn)?zāi)Ｊ? POCT是一種在采樣現(xiàn)場立即進(jìn)行分析的新方法，不需要在實(shí)驗(yàn)室測試中對標(biāo)本進(jìn)行復(fù)雜的處理程序，可以快速獲得檢驗(yàn)結(jié)果。微流體技術(shù)具有低成本、高通量、快速、易于微型化等優(yōu)勢，被廣泛應(yīng)用于POCT領(lǐng)域。DVBOX(DetectVirus BOX)也稱為檢毒BOX, 是由中國自主研發(fā)的一款全封閉、超高靈敏度的一體式微流控SARS-CoV-2核酸檢測POCT設(shè)備[10], 具有低實(shí)驗(yàn)操作環(huán)境要求、高靈敏度、低假陰性率、低檢測成本、無需運(yùn)輸樣本、檢測時(shí)間短、不需要大量經(jīng)專業(yè)防護(hù)和實(shí)驗(yàn)操作培訓(xùn)的技術(shù)人員等優(yōu)勢。

2.4 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

RT-PCR因其高靈敏度、高準(zhǔn)確度等優(yōu)勢而被廣泛用于SARS-CoV-2的檢測，但仍然存在一定的局限，例如對溫控精度高的熱循環(huán)儀的依賴而導(dǎo)致檢測時(shí)間較長，因而無法實(shí)時(shí)快速地檢測SARS-CoV-2。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)可在等溫條件下快速、高效地?cái)U(kuò)增，非常適合SARS-CoV-2核酸的現(xiàn)場快速檢測。LAMP是一種新型的核酸擴(kuò)增方法，在引物和鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)的作用下, 60～65 ℃恒溫?cái)U(kuò)增, 15～60 min即可實(shí)現(xiàn)109～1010倍的核酸擴(kuò)增，一般針對靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4～6種特異引物以提高特異性，具有操作簡便、特異性強(qiáng)、產(chǎn)物易檢測等優(yōu)點(diǎn)，可廣泛用于感染性疾病的檢測。

HONG T C T等[11]基于LAMP技術(shù)開發(fā)了一種單步單管加速實(shí)時(shí)定量RT-LAMP測定法，對臨床49份標(biāo)本檢測, RT-LAMP分析的檢測靈敏度是RT-PCR的100倍，檢測極限為0.01 PFU。ANAHTAR M N等[12]利用RT-LAMP對135例鼻咽標(biāo)本進(jìn)行了COVID-19感染評估，通過優(yōu)化樣本, RT-LAMP可利用有限的設(shè)備實(shí)現(xiàn)快速且準(zhǔn)確的SARS-CoV-2檢測，有成為理想檢測方法的潛力，尤其是在資源有限的環(huán)境下。LAMB L E等[13]確定了RT-LAMP的最佳條件: 63 ℃溫育30 min。YU L等[14]基于LAMP技術(shù)進(jìn)行優(yōu)化，開發(fā)了iLACO快速檢測技術(shù)，該技術(shù)以O(shè)RF1ab基因?yàn)闄z測靶區(qū)進(jìn)行LAMP等溫?cái)U(kuò)增，靈敏度與基于Taq酶的RT-PCR相當(dāng)，同時(shí)可以利用測序比對區(qū)分SARS-CoV-2與其他病毒，確保了檢測的特異性。

RT-LAMP具有操作簡單、快速高效、檢測靈敏、特異性高等優(yōu)勢，可用于快速篩查，但極易污染而產(chǎn)生假陽性結(jié)果，故要特別注意嚴(yán)謹(jǐn)操作。此外, RT-LAMP目前使用的引物組的靈敏度不足以充分檢測出低病毒載量人群的感染[10]。RT-LAMP技術(shù)若在產(chǎn)物的回收鑒定、克隆、單鏈分離等方面加以完善和改進(jìn)，對檢測性能的提高有著積極的意義[15]。

3 血清學(xué)檢測

目前, RT-PCR檢測陽性是公認(rèn)的診斷臨床疑似病例的確診標(biāo)準(zhǔn)。然而, RT-PCR檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性很大程度上依賴于病毒載量，低病毒載量易出現(xiàn)假陰性結(jié)果。血清學(xué)檢測操作便捷、耗時(shí)少，可以作為核酸檢測的有益補(bǔ)充，輔助臨床診斷[16]。同時(shí)，《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)》[17]明確將SARS-CoV-2特異性抗體檢測納入確診病例的診斷標(biāo)準(zhǔn)以及疑似病例的排除標(biāo)準(zhǔn)。感染SARS-CoV-2后，免疫球蛋白M(IgM)最早可在感染后的第3天被檢測到，其峰值出現(xiàn)在感染后2～3周; 免疫球蛋白G(IgG)最早可在4 d內(nèi)出現(xiàn)，并在17 d內(nèi)達(dá)到峰值[18]。血清學(xué)檢測方法主要包括膠體金法、酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)和化學(xué)發(fā)光免疫分析(CLIA), 具有靈敏度高、簡便、范圍廣、易推廣等優(yōu)點(diǎn)。

3.1 膠體金法

膠體金法是一種以膠體金作為示蹤標(biāo)志物檢驗(yàn)抗原抗體的免疫標(biāo)記檢測技術(shù)，無需專業(yè)、昂貴的設(shè)備和試劑，具有操作簡單、結(jié)果迅速等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于病原體檢測領(lǐng)域。

鄧杰倫等[19]對76例患者血清IgM和總抗體進(jìn)行了膠體金檢測，特異性均>90%, 陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值均>70%, 可以滿足臨床要求，輔助臨床診斷。LI Z T等[20]基于免疫膠體金技術(shù)的原理，創(chuàng)新地研發(fā)了IgM-IgG聯(lián)合抗體快速檢測方法，可以在15 min內(nèi)確認(rèn)近期是否有SARS-CoV-2感染。彭孝斌等[21]分別采用ELISA與膠體金法對26例確診病例和54例發(fā)熱患者進(jìn)行IgM及IgG檢測，結(jié)果表明，在現(xiàn)有的試劑條件下，膠體金法較ELISA操作更為簡便、快捷，更適合基層實(shí)驗(yàn)室。

膠體金法多以靜脈血和指尖血為檢測樣本，易于獲取，短時(shí)間內(nèi)即可得到檢測結(jié)果，因而適用于大規(guī)模人群篩查。但由于較低的靈敏度和較長的檢測窗口期，膠體金法尚不能作為SARS-CoV-2確診和排除的唯一依據(jù)[20]。

3.2 CLIA

CLIA是一種具有化學(xué)發(fā)光測定技術(shù)的高靈敏度與免疫反應(yīng)的高特異度新型檢測分析技術(shù)，其原理是以磁微粒作為固相載體，通過對化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的檢測來確定待測物濃度。CLIA的主要優(yōu)勢有: ① 樣本易于獲得; ② 具有快速高效，靈敏度高，可實(shí)現(xiàn)對樣本全自動、高通量檢測等優(yōu)勢。但是, CLIA也存在一系列問題，如抗體檢測窗口期長、假陽性率高等。

重慶醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合博奧賽斯生物科技有限公司研發(fā)的SARS-CoV-2化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒是全球首批獲批的磁微粒化學(xué)發(fā)光SARS-CoV-2 IgG/IgM檢測試劑盒，已累計(jì)完成13 532例樣本測試，其中1 362例為COVID-19確診病例，結(jié)果顯示IgM靈敏性為93.7%, 特異性為99.4%, IgG靈敏性為89.6%, 特異性為99.2%。廖凡路等[22]發(fā)現(xiàn)部分確診患者SARS-CoV-2核酸檢測始終為陰性，而SARS-CoV-2抗體的檢測，尤其是總抗體對其敏感性很高(總抗體檢測陽性率為100%), 表明增加SARS-CoV-2抗體的檢測對于臨床確診患者的診斷有十分重要的意義。數(shù)據(jù)分析[23]表明，化學(xué)發(fā)光抗體檢測試劑仍不能取代RT-PCR確診檢測，且需要專業(yè)的化學(xué)發(fā)光檢測設(shè)備，也不適用于人群篩查。

3.3 ELISA

ELISA是目前最常用的免疫分析方法，其原理是利用抗原、抗體間專一性鍵結(jié)合的特性進(jìn)行檢測。由于結(jié)合于聚苯乙烯載體上的SARS-CoV-2抗原仍具有免疫活性，配合酶促呈色反應(yīng)，即可顯示人血清中是否存在SARS-CoV-2抗體，并可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定量分析。

胡燕等[24]利用ELISA分別對116例COVID-19患者和346例非COVID-19者的血清SARS-CoV-2抗體進(jìn)行檢測, ELISA檢測血清SARS-CoV-2 IgG抗體的敏感性為63.79%, 特異性為96.53%, 準(zhǔn)確性為88.31%; ELISA檢測血清SARS-CoV-2 IgM抗體的敏感性為58.62%, 特異性為97.40%, 準(zhǔn)確性為87.66%, 可以滿足實(shí)驗(yàn)室檢測需要。

ELISA的靈敏度高、特異度高、檢測成本低，但是操作較為繁瑣，在抗體檢測的窗口期以及感染初期難以獲得準(zhǔn)確的檢測結(jié)果，使得ELISA只能作為SARS-CoV-2核酸檢測陰性疑似病例的補(bǔ)充檢測手段。

4 總結(jié)與展望

目前，核酸檢測仍是SARS-CoV-2主流的早期檢測手段，對SARS-CoV-2的傳播起著重要的預(yù)防作用。但是，目前的核酸檢測方法也存在一些局限性，包括檢測靈敏度低、檢測時(shí)間長、對實(shí)驗(yàn)環(huán)境和人員要求高、在臨床應(yīng)用中容易出現(xiàn)假陰性結(jié)果等。相比較而言，血清學(xué)檢測操作便捷、耗時(shí)少，但機(jī)體對SARS-CoV-2的免疫反應(yīng)導(dǎo)致血清學(xué)檢測無法對COVID-19患者進(jìn)行早期即時(shí)篩查，因此建議將核酸檢測與血清學(xué)檢測結(jié)合使用以提高COVID-19的檢測精度。此外，影像學(xué)檢查也是COVID-19的重要檢測手段，聯(lián)合應(yīng)用可提供更加可靠的診斷結(jié)果[25]。

目前，疫情防控重點(diǎn)在于對無癥狀感染者進(jìn)行有效監(jiān)測，技術(shù)創(chuàng)新就顯得極為重要，提高靈敏度和準(zhǔn)確度、高通量檢測、自動化、便攜等是目前新技術(shù)開發(fā)的主要方向。隨著上述新技術(shù)的發(fā)展，對COVID-19患者的檢測和診斷能力將進(jìn)一步提高。