徐小龍 江 鵬 羅景印 張劍歌 黃海鵬

(廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院泌尿外科，南寧市 530007，電子郵箱：gzzyxxl@163.com)

腎間質(zhì)纖維化(renal interstitial fibrosis，RIF)是許多病因?qū)е碌哪I功能衰竭的共同途徑和病理表現(xiàn)，是目前臨床研究的熱點問題，主要表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)成分的生成和降解失衡[1]。穿刺活檢是目前診斷RIF的金標(biāo)準(zhǔn),但因其具有創(chuàng)傷性，很難成為臨床上持續(xù)性跟蹤的常規(guī)檢查手段，因此探索一種診斷RIF的無創(chuàng)方法具有重要的臨床意義。近年來，許多學(xué)者試圖揭開miRNA與器官纖維化發(fā)生和發(fā)展的關(guān)系，尋求診斷和治療的新靶點。研究表明，在單側(cè)輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction，UUO)小鼠模型中，隨著RIF程度的加重，其腎組織中miR-29的表達(dá)水平下降，并預(yù)測miR-29可以通過抑制轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)發(fā)送信號來發(fā)揮抗纖維化作用[2]。miR-29家族包括miR-29a、miR-29b、miR-29c，研究表明，UUO小鼠模型腎組織miR-29c表達(dá)量與RIF病情程度關(guān)系密切[3]，但是該研究并未就血清中miR-29c的表達(dá)水平與RIF的關(guān)系做進(jìn)一步的闡明。本研究通過建立成熟大鼠UUO模型，探討大鼠血清和腎組織中miR-29c表達(dá)水平與RIF的相關(guān)性，及其與TGF-β1/Smad3纖維化信號通路的關(guān)系。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑 20只4周齡雄性SD大鼠購于南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心[許可證號：SCXK(粵)2006-0015]，體質(zhì)量在200～250 g之間，飼養(yǎng)于動物實驗中心，飼養(yǎng)食物為專用鼠糧，正常進(jìn)水，飼養(yǎng)中心保持通風(fēng)清潔，溫度在25℃左右。TRI Reagent BD(RNA抽提試劑)購自濟南科賽特科技公司(批號：TB126-500)；氯仿、異丙醇、100%乙醇、0.02 M乙酸鈉、甲醛均購自上?；瘜W(xué)試劑有限公司；75%乙醇(100%乙醇為原料，以DEPC處理水配制而成)；冰醋酸購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(批號：1000218)；無RNA酶的水和無RNA酶的糖原購自美國Invitrogen Life Technologies公司(批號：AM9930、A216-01)；TE緩沖液(pH 8,含10 mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽，1 mM乙二胺四乙酸)和0.2 M MOPS緩沖液(pH 7.0)購自華美生物工程公司(批號：AA0060-500ml、BJ-P64004)；甲醛上樣染液購自上海Ambion公司(批號：XH051)；GoldView染料購自上海賽百勝基因技術(shù)有限公司(批號：PH0621)；瓊脂糖購自上海生工生物工程有限公司(批號：A600015-0025)；RNA酶抑制劑、MMLV反轉(zhuǎn)錄酶、10×RT緩沖液均購自北京Epicentre公司(批號：PM11369、M4425H、T1087)；2.5 mM dNTP混合液(dATP、dGTP、dCTP和dTTP各2.5 mM)購自美國HyTest有限公司(批號：R72501)；RT Primers購自上海百力格生物技術(shù)有限公司(批號：4399966)；2×PCR Master Mix購自美國Arraystar公司(批號：K0171)；RNALater保存液購自上海前塵生物科技有限公司(批號：AM70210)；TGF-β1和Smad3免疫組化試劑盒購自美國St.Louis生物公司(批號：7754-BH-005/CF、AF3797-SP)，TGF-β1、Smad3一抗均為兔抗鼠多克隆抗體。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組及模型建立：將20只SD雄性大鼠按隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組(Sham組)和UUO組，每組10只。采用2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)進(jìn)行腹腔注射麻醉，在左側(cè)腹腎區(qū)做一2～3 cm切口后打開腹腔，游離大鼠左側(cè)輸尿管，分別于近左腎門處和輸尿管上1/3水平處結(jié)扎UUO組大鼠輸尿管，僅游離Sham組大鼠輸尿管但不結(jié)扎；然后縫合腹壁，術(shù)后將大鼠放置于清潔干燥環(huán)境中飼養(yǎng)，自由進(jìn)食水。實驗結(jié)束后，在獲取標(biāo)本時觀察輸尿管和腎盂情況，如術(shù)側(cè)結(jié)扎部位以上輸尿管、腎盂明顯擴張，且腎盂較對側(cè)明顯增大，則表明建模成功，本實驗建模成功率為100%。

1.2.2 大鼠血液及術(shù)側(cè)腎組織標(biāo)本獲?。耗Ｐ徒⒑蟮?天和第7天，采用單純隨機抽樣法分別從各組中抽取5只大鼠，采用2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)進(jìn)行腹腔注射麻醉，打開大鼠的腹腔和胸腔，心臟取全血2～3 mL置于乙二胺四乙酸抗凝管中，在室溫下(25℃左右)1 200 r/min離心30 min后分離血清，放入-80℃冰箱保存?zhèn)溆?；心臟取血后立即使用冰鹽水進(jìn)行心臟灌注，直至術(shù)側(cè)腎臟變蒼白后取出術(shù)側(cè)腎臟，去除腎臟表面組織，垂直于腎臟長軸切取2塊1～2 mm厚的腎組織，分別置于4%甲醛和RNALater保存液中，放入-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。本研究對所有動物的處理均符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)規(guī)定。

1.2.3 血清及腎組織miR-29c表達(dá)水平的測定：取1.2.2步驟所獲得的血清和RNALater保存液中的腎臟組織標(biāo)本，按照試劑盒說明書，經(jīng)勻漿、兩相分離、RNA沉淀、RNA清洗、重新溶解RNA沉淀后，提取血清及腎組織中的總RNA；以RNA為模板、RT混合液為反應(yīng)液，使用實時熒光定量PCR擴增儀進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。反轉(zhuǎn)錄混合反應(yīng)液包括dNTP(2.5 mM)2 μL、10×RT緩沖液2 μL、反轉(zhuǎn)錄特異引物(1 μM)0.3 μL、總RNA 600 ng、MMLV反轉(zhuǎn)錄酶(200 U/μL)0.2 μL、RNA酶抑制劑(40 U/μL) 0.3 μL，加無RNA酶水至總體積為20 μL。反應(yīng)條件為16℃ 30 min、42℃ 40 min、85℃ 5 min。反轉(zhuǎn)錄中，內(nèi)參U6引物序列為5′CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT3′，rno-miR-29c引物序列為5′GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACTAACCG3′。獲取cDNA后進(jìn)行PCR擴增，反應(yīng)體系包括2×Master Mix 5 μL、10 μmol/L的PCR特異上游引物0.5 μL、10 μmol/L的PCR特異下游引物0.5 μL、加水至總體積為8 μL。將上述溶液混合，5 000 r/min短暫離心后，將8 μL混合液加到384-PCR板對應(yīng)的每個孔中，再加入對應(yīng)的2 μL cDNA，粘上封口膜，將384-PCR板短暫離心后置于實時熒光定量PCR儀上進(jìn)行PCR擴增，反應(yīng)條件為95℃，10 min；40個循環(huán)(95℃，10 s；60℃，60 s)；為了建立PCR產(chǎn)物溶解曲線，在上述擴增反應(yīng)基礎(chǔ)上，加溶解曲線反應(yīng)條件(95℃,10 s；60℃,60 s；95℃,15 s)，溫度降到60℃后再緩慢加熱到99℃，可獲得溶解曲線。反應(yīng)結(jié)束后分析PCR產(chǎn)物溶解曲線，并以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算目的基因表達(dá)量。qRT-PCR反應(yīng)中，內(nèi)參U6上游引物序列為5′GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT3′，下游引物序列為5′CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT3′； 對應(yīng)miRNA的特異引物5′GGGTAGCACCATTTGAAA3′，與反轉(zhuǎn)錄引物相匹配的引物5′TGCGTGTCGTGGAGTC3′。

1.2.4 腎組織Masson染色：取1.2.2步驟中置于4%甲醛的腎臟組織標(biāo)本行Masson染色，觀察RIF程度。取4%多聚甲醛固定的腎組織，經(jīng)蒸餾水沖洗、固定、脫水、透明、浸蠟和包埋后，切成厚約3 μm的切片，二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，蒸餾水沖洗。麗春紅、酸性品紅染色15 min，1%冰醋酸洗2次，2 min/次。1%磷鉬酸染色5 min。1%冰醋酸洗2次，2 min/次，1%亮綠染色15 min，1%冰醋酸洗2次，2 min/次，脫水，透明，封固。按Banff分級半定量評分[6]評估RIF纖維化程度。每個標(biāo)本在光鏡下隨機選取10個不重復(fù)的腎皮質(zhì)區(qū)(×200)，通過觀察以下5個參數(shù)評估RIF病變程度，即腎小管萎縮、間質(zhì)纖維化、水腫、炎性反應(yīng)、小管再生或退行性病變，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件計算每個參數(shù)占視野的百分比，每個參數(shù)根據(jù)病變范圍的百分比按0～3分評定，0分為正常，1分為病變范圍<25%，2分為病變范圍在25%～50%之間，3分為病變范圍>50%，每個視野5個參數(shù)得分之和為該視野的評分。

1.2.5 腎組織免疫組化：取1.2.2步驟中置于4%甲醛的腎臟組織標(biāo)本，采用EliVision法進(jìn)行免疫組化。將3 μm石蠟切片脫蠟至水，檸檬酸緩沖液沸水煮20 min修復(fù)抗原，3%過氧化氫滅活內(nèi)源性酶，兔抗鼠TGF-β1(1 ∶100)、Smad3(1 ∶100)多克隆抗體4℃孵育過夜，滴加聚合物增強劑后滴加酶標(biāo)抗鼠/兔聚合物，DAB顯色，顯微鏡下控制顯色反應(yīng)；蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片。采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件，每個標(biāo)本隨機選取10個不重復(fù)視野(×200)觀察抗體陽性表達(dá)情況(抗體陽性表達(dá)部位呈黃色)，計算每個視野中陽性面積所占視野面積的百分比。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以(x±s)表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，組內(nèi)比較采用配對t檢驗；采用Spearman秩相關(guān)檢驗進(jìn)行相關(guān)性分析。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組大鼠血清和腎組織miR-29c表達(dá)水平的比較 建模后3 d、7 d，UUO組大鼠血清和腎臟組織的miR-29c表達(dá)水平均低于Sham組(均P<0.05)； 建模后7 d UUO組大鼠的血清和腎臟組織miR-29c表達(dá)水平均低于建模后3 d(均P<0.05)，而在Sham組中不同時間點miR-29c表達(dá)水平差異則無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。見表1。

表1 兩組大鼠血清和腎組織miR-29c相對表達(dá)水平的比較(x±s)

2.2 兩組大鼠的RIF程度比較 Masson染色結(jié)果顯示，建模后3 d、7 d，Sham組大鼠腎組織基本正常，未見明顯變化。建模后3 d,UUO組大鼠腎組織出現(xiàn)灶狀小管上皮扁平化、管腔擴張，腎間質(zhì)散在單個核細(xì)胞浸潤和腎間質(zhì)輕度水腫，腎小球結(jié)構(gòu)基本正常；建模后7 d，UUO組大鼠腎小球明顯水腫，腎間質(zhì)廣泛存在單個核細(xì)胞浸潤、間質(zhì)明顯水腫。建模后3 d、7 d，UUO組大鼠的RIF程度評分均高于Sham組，且UUO組大鼠建模后7 d的RIF程度評分高于建模后3 d的RIF程度評分(均P<0.05)。見表2、圖1。

圖1 兩組大鼠腎組織病理學(xué)改變(Masson染色,×200)

表2 兩組大鼠腎組織RIF程度評分的比較(x±s,分)

2.3 兩組大鼠腎組織TGF-β1、Smad3蛋白表達(dá)水平的比較 建模后3 d、7 d，UUO組大鼠腎組織的TGF-β1和Smad3蛋白表達(dá)水平均高于Sham組(均P<0.05)；UUO組大鼠建模后7 d的腎組織TGF-β1和Smad3蛋白表達(dá)水平均高于建模后3 d的表達(dá)水平(均P<0.05)，而建模后3 d、7 d，Sham組的TGF-β1、Smad3蛋白表達(dá)水平差異并無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。見表3、圖2、圖3。

圖2 兩組大鼠腎組織的TGF-β1蛋白表達(dá)情況(免疫組化染色,×200)

圖3 兩組大鼠腎組織的Smad3蛋白表達(dá)情況(免疫組化染色,×200)

表3 兩組大鼠腎組織TGF-β1、Smad3蛋白相對表達(dá)水平的比較(x±s，%)

2.4 UUO組大鼠miR-29c、TGF-β1蛋白、Smad3蛋白表達(dá)水平與RIF程度的相關(guān)性 UUO組大鼠血清和腎組織miR-29c表達(dá)水平與RIF程度評分均呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.581、-0.712，均P<0.001)；血清和腎組織的miR-29c表達(dá)水平與腎組織TGF-β1、Smad3蛋白表達(dá)水平均呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.741、-0.695、-0.682、-0.594,均P<0.001)；腎組織TGF-β1、Smad3蛋白表達(dá)水平與RIF程度評分均呈正相關(guān)(rs=0.631、0.684，均P<0.001)；血清miR-29c表達(dá)水平與腎組織miR-29c表達(dá)水平呈正相關(guān)(rs=0.752，P<0.001)；腎組織TGF-β1蛋白表達(dá)水平與Smad3蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān)(rs=0.812，P<0.001)。

3 討 論

miRNA是由20～23個核苷酸組成的短鏈非編碼RNA序列，編碼miRNA的基因主要位于染色體的內(nèi)含子或非編碼外顯子，由miRNA基因在RNA聚合酶Ⅱ作用下轉(zhuǎn)錄形成初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,在輸出蛋白復(fù)合物作用下，初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物由核內(nèi)被輸送至細(xì)胞質(zhì)，經(jīng)核糖核酸酶Ⅲ剪切為21～23nt的雙鏈miRNA。成熟的miRNA被保留在RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體中，通過抑制靶基因的表達(dá)發(fā)揮調(diào)控靶基因的作用[4]，在不同的生物學(xué)進(jìn)程及病理進(jìn)程中發(fā)揮重要作用，包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、腫瘤發(fā)生和發(fā)展、器官的形成、組織纖維化、瘢痕形成等[5]，且 miRNA在血清、組織、尿液或其他體液中的表達(dá)比較穩(wěn)定[6]。研究表明，miR-192、miR-21表達(dá)水平升高可促進(jìn)腎臟纖維化,miR-29c表達(dá)水平升高可抑制腎臟纖維化[7-8]。miR-29包括miR-29a、miR-29b和miR-29c，在成熟的組織細(xì)胞中廣泛表達(dá)，在腎臟、心臟、肺組織中的表達(dá)尤為明顯[9-11]。Qin等[12]的研究表明，大鼠纖維化腎組織中的miR-29表達(dá)水平與RIF程度呈負(fù)相關(guān)，并檢測到纖維化腎組織中的Smad3蛋白表達(dá)水平升高。TGF-β1是公認(rèn)的最主要的致纖維化因子，主要是通過TGF-β1/Smad3通路介導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，在RIF的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用[13]。Smad蛋白是TGF-β1信號傳導(dǎo)通路中的重要傳導(dǎo)介質(zhì)，到目前為止共發(fā)現(xiàn)11種Smad蛋白，根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能的不同其可分為三大類，即受體激活型(R-Smads)、共用型(Co-Smads)、抑制型(I-Smads)，TGF-β1在調(diào)控組織或器官纖維化過程中首先與絲氨酸/蘇氨酸激酶受體Ⅱ型受體結(jié)合，使Ⅱ型受體發(fā)生磷酸化后轉(zhuǎn)變成激活受體，激活的Ⅱ型受體又使細(xì)胞膜上的Ⅰ型受體活化，活化的Ⅰ型受體可使細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的某些信號蛋白分子(主要是Smad3蛋白)磷酸化，磷酸化的Smad3蛋白分子與Smad4蛋白分子結(jié)合成復(fù)合物轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后的過程，而這種過程主要是通過miRNA的調(diào)控來實現(xiàn)[14-15]。已有研究證實miR-29c在大鼠UUO腎組織中的表達(dá)水平與RIF程度呈負(fù)相關(guān)[16]，但UUO血清中miR-29c表達(dá)水平與RIF的相關(guān)性如何目前尚未清楚。

本研究檢測UUO大鼠模型的miR-29c水平，并分析其與RIF程度的相關(guān)性。結(jié)果顯示，建模后3 d、7 d，UUO組大鼠梗阻側(cè)腎臟較對側(cè)增大，病理證實纖維化加重，表示建模成功。且在建模后相同時間點，與Sham組大鼠比較，UUO組大鼠腎組織的RIF程度明顯加重，血清與腎組織的miR-29c表達(dá)水平降低，腎組織的TGF-β1與Smad3蛋白表達(dá)水平均升高；且隨著RIF程度的加重，UUO組大鼠血清與腎組織miR-29c表達(dá)水平逐漸降低，腎組織TGF-β1及Smad3蛋白表達(dá)水平逐漸升高；相關(guān)性分析結(jié)果顯示，UUO組大鼠血清與腎組織的miR-29c表達(dá)水平與RIF程度評分、TGF-β1及Smad3蛋白表達(dá)水平均呈負(fù)相關(guān)(均P<0.05)，提示在腎纖維化進(jìn)程中，miR-29c與TGF-β1、Smad3呈負(fù)反饋調(diào)節(jié)關(guān)系。

綜上所述，腎纖維化大鼠血清和腎組織中的miR-29c表達(dá)水平降低，且與RIF程度呈負(fù)相關(guān)，miR-29c可能通過調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad3通路參與腎纖維化的發(fā)生與發(fā)展。血清miR-29c有可能成為診斷腎纖維化的無創(chuàng)性指標(biāo)。本研究的局限性在于miR-29c與RIF的相關(guān)性仍是推論，且本研究的實驗對象為大鼠UUO模型，所得結(jié)論是否適用于人體，還需進(jìn)一步研究。