郭青，劉珍

(鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院 呼吸科，河南 鄭州 450000)

支氣管哮喘屬于我國兒童呼吸系統(tǒng)常見的慢性氣道炎癥疾病。炎癥使氣道可逆性狹窄并導(dǎo)致患兒出現(xiàn)呼吸困難，支氣管哮喘的炎癥反應(yīng)由多種抗原特異性炎癥細(xì)胞所介導(dǎo)，因此可造成喘息的反復(fù)發(fā)作[1-3]。孟魯司特鈉是有效且安全的白三烯受體拮抗劑，是一種廣泛被用于治療兒童支氣管哮喘的藥物，在控制氣道炎癥和免疫方面的作用顯著[4]。孟魯司特鈉能降低支氣管哮喘兒童血清免疫球蛋白E(immunoglobulin E，IgE)水平，并能在一定程度上減少支氣管哮喘急性發(fā)作頻次，長期規(guī)范應(yīng)用有助于實現(xiàn)支氣管哮喘的臨床控制[5]。但孟魯司特鈉的作用機(jī)制是否與核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)通路有關(guān)，國內(nèi)外文獻(xiàn)均尚無定論。本研究以支氣管哮喘大鼠為研究對象，探討孟魯司特鈉對支氣管哮喘大鼠肺組織的保護(hù)作用，并進(jìn)一步探討了孟魯司特鈉對NF-κB通路的調(diào)控作用，為其在兒童支氣管哮喘發(fā)作中的應(yīng)用提供實驗理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般資料40只約4周齡雄性清潔級Sprauge-Dawley大鼠，屬遠(yuǎn)交群，體質(zhì)量(160.00±10.00)g，購自鄭州大學(xué)實驗動物中心。大鼠被隨機(jī)分為對照組、哮喘模型組、孟魯司特鈉低劑量組、孟魯司特鈉高劑量組，每組10只。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，其中哮喘模型組、孟魯司特鈉高劑量組、孟魯司特鈉低劑量組大鼠均被誘導(dǎo)成哮喘模型。本研究經(jīng)鄭州大學(xué)倫理委員會審核并批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號2018-KY-89)。

1.2 試劑名稱與檢測儀器孟魯司特鈉(杭州默沙東制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字J20130054)。卵白蛋白(ovalbumin，OVA)(美國Sigma公司)，10%氫氧化鋁[Al(OH)3](上?；瘜W(xué)試劑有限公司)，魚躍403C型霧化器(江蘇醫(yī)療設(shè)備有限公司)，白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附劑測定試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技有限公司)。

1.3 大鼠哮喘模型的建立[6]在第1日和第8日，于哮喘模型組和孟魯司特鈉低劑量組(5 mg·kg-1)、孟魯司特鈉高劑量組(10 mg·kg-1)大鼠腹腔注射OVA和 Al(OH)3混合液 1 mL[含OVA、Al(OH)3各100 mg]予以致敏處理。第15日，給予哮喘模型組和孟魯司特鈉低劑量組、高劑量組霧化吸入20 g·L-1的OVA進(jìn)行過敏激發(fā)，每次30 min，每日1次，連續(xù)6 d。大鼠出現(xiàn)呼吸心率加快、擺頭、打噴嚏、點頭呼吸時有聲響、持續(xù)抓鼻孔、咳嗽、煩躁不安等表現(xiàn)說明哮喘模型成功建立。從第15日開始，對孟魯司特鈉低劑量組、孟魯司特高劑量組大鼠每次OVA霧化前30 min按不同劑量灌胃，連續(xù)14 d。對照組和哮喘模型組以生理鹽水灌胃。觀察并記錄第20日各組大鼠24 h內(nèi)的進(jìn)食量與飲水量，第21日應(yīng)用自主活動儀測定5 min的活動次數(shù)與10 min的抓鼻次數(shù)[7]。

1.4 標(biāo)本采集及肺泡灌洗液中IL-1β、IL-6、TNF-α的檢測均在末次霧化后24 h內(nèi)將各組大鼠麻醉并處死，備皮并固定于動物手術(shù)臺，暴露氣管，沿環(huán)狀軟骨下緣做T形切口行氣管插管，經(jīng)插管注入5 mL生理鹽水后回抽肺泡灌洗液，重復(fù)3次，回收率>80%為合格，收集于離心管中備用。游離右肺后自肺口近端離斷，置于400 g·L-1多聚甲醛溶液中固定備用。按照酶聯(lián)免疫吸附試劑盒說明書檢測肺泡灌洗液中IL-1β、IL-6、TNF-α水平，測出各個樣本指標(biāo)相應(yīng)的光密度(optical density，OD)值，根據(jù)相應(yīng)水平的OD值計算相應(yīng)濃度。

1.5 采用蛋白免疫印跡法檢測各組大鼠肺組織p-p65、NF-κB的抑制蛋白α(inhibitor α of NF-κB，IκBα)表達(dá)水平準(zhǔn)確稱取以上各組大鼠肺組織250 mg，置入tube管內(nèi)并加入0.5 mL裂解液進(jìn)行勻漿，4 ℃下12 000×g離心2 min，舍棄沉淀物取上清液。以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，電轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜，隨后加入一抗、二抗化學(xué)發(fā)光試劑顯影，以β-actin蛋白作為內(nèi)參。采用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的蛋白和內(nèi)參蛋白的比值作為目的蛋白的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 大鼠的一般情況各組大鼠進(jìn)食量、飲水量、活動次數(shù)、抓鼻次數(shù)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與對照組相比，哮喘模型組和孟魯司特鈉低劑量組每日進(jìn)食量、飲水量減少，活動次數(shù)、抓鼻次數(shù)增加(P<0.05)。孟魯司特鈉低劑量組每日進(jìn)食量、每日飲水量、活動次數(shù)、抓鼻次數(shù)與哮喘模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 4組每日進(jìn)食量、每日飲水量、活動次數(shù)、抓鼻次數(shù)比較

2.2 大鼠肺泡灌洗液中炎癥因子的表達(dá)水平各組肺泡灌洗液IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與對照組相比，哮喘模型組和孟魯司特鈉低劑量組IL-1β、IL-6、TNF-α水平較高(P<0.05)。與哮喘模型組比較，孟魯司特鈉低劑量組和孟魯司特高劑量組IL-1β、IL-6、TNF-α水平較低(P<0.05)。孟魯司特鈉低劑量組IL-1β、IL-6、TNF-α水平與孟魯司特鈉高劑量組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠肺泡灌洗液IL-1β、IL-6、TNF-α 水平比較

2.3 大鼠肺組織p-p65、IκBα表達(dá)水平各組肺組織p-p65、IκBα表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與對照組比較，哮喘模型組p-p65表達(dá)上調(diào)，IκBα表達(dá)下調(diào)(P<0.05)。與哮喘模型組相比，孟魯司特鈉低劑量組和孟魯司特高劑量組p-p65表達(dá)水平較低，IκBα表達(dá)水平較高(P<0.05)。孟魯司特鈉低劑量組與孟魯司特鈉高劑量組p-p65、IκBα表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組肺組織p-p65、IκBα表達(dá)水平比較

3 討論

支氣管哮喘為一種兒童肺部常見的慢性氣道異質(zhì)性疾病，特點是氣道阻塞和氣道高反應(yīng)性。在臨床上，支氣管哮喘患兒往往表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的咳嗽、喘息、胸悶和氣短[8]。本研究結(jié)果顯示，哮喘模型組大鼠每日進(jìn)食量和飲水量均減少，活動次數(shù)及抓鼻次數(shù)均增加。這進(jìn)一步證明了支氣管哮喘可能導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)鼻癢、煩躁不安、飲食及睡眠質(zhì)量下降等癥狀。這與支氣管哮喘本身的過敏反應(yīng)有關(guān)，表明支氣管哮喘對大鼠造成了嚴(yán)重的不良影響。孟魯司特鈉作為抗過敏平喘藥長期應(yīng)用于兒童哮喘的臨床預(yù)防及基礎(chǔ)治療中，通過競爭性抑制白三烯受體的活性，進(jìn)而顯著減少支氣管哮喘患兒呼吸道炎癥細(xì)胞聚集和黏液分泌，緩解患兒呼吸道平滑肌痙攣，輔助改善哮喘發(fā)作的癥狀，長期規(guī)律給藥有助于實現(xiàn)輕中度支氣管哮喘的臨床控制[9-10]。進(jìn)一步對比研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與哮喘模型組比較，加入孟魯司特鈉治療后大鼠的進(jìn)食量、飲水量、活動次數(shù)及抓鼻次數(shù)變化不顯著。這可能是由于實驗中未對大鼠進(jìn)行其他抗喘息治療手段的干預(yù)，也說明針對哮喘需要抗炎、平喘、抑制氣道高反應(yīng)、解除氣管痙攣等全方位的治療措施。孟魯司特鈉的具體作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步探討。

支氣管哮喘發(fā)病的分子機(jī)制與多個發(fā)病因素共同作用相關(guān)。支氣管哮喘發(fā)作時，患者體內(nèi)可能釋放出大量的高濃度的炎癥介質(zhì)，導(dǎo)致支氣管哮喘患兒氣道出現(xiàn)持續(xù)高反應(yīng)性，多種支氣管炎癥細(xì)胞可以參與哮喘的發(fā)病過程[11]。免疫細(xì)胞異常導(dǎo)致IL異常表達(dá)，尤其是IL-1β、IL-6，在支氣管哮喘病理過程中起到關(guān)鍵作用[12]。IL-1β是IL-1的主要活化表達(dá)形式，是一種高特異性的敏感炎癥指標(biāo)[13]。Bakr等[14]研究已證實，IL-1β可以作為引起哮喘急性癥狀發(fā)作的一個重要炎癥因子，主要參與免疫趨化因子和免疫黏附分子的異常表達(dá)、淋巴細(xì)胞增殖活化、嗜酸性粒細(xì)胞浸潤、肥大細(xì)胞脫顆粒等過程。IL-6作為支氣管哮喘的另一個重要炎癥因子，是由淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞激活后合成的，參與機(jī)體炎癥損傷過程。徐莉等[15]研究還發(fā)現(xiàn)，哮喘患者急性發(fā)作時血漿中IL-6的表達(dá)水平高于正常，緩解期血漿中IL-6表達(dá)水平幾乎與正常人的無差異。哮喘急性發(fā)作治療時，患者IL-6表達(dá)水平也與IgE水平呈正相關(guān)。TNF-α屬于人體血漿中一種Th1型細(xì)胞因子，可直接損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)白細(xì)胞的吸附，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，參與免疫調(diào)節(jié)作用[16-17]。本研究結(jié)果顯示，IL-1β、IL-6、TNF-α水平在哮喘模型大鼠中呈明顯高表達(dá)，說明了IL-1β、IL-6、TNF-α細(xì)胞因子可共同作用，吞噬體內(nèi)免疫系統(tǒng)，促進(jìn)哮喘的發(fā)展進(jìn)程。NF-κB是一種廣泛表達(dá)和存在于生物各類復(fù)雜的真核細(xì)胞基因簇內(nèi)的具有多向性的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)過程，控制多種復(fù)雜的細(xì)胞因子、生化因子和酶等功能基因表達(dá)[18]。支氣管哮喘的肺部炎癥機(jī)理與復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)轉(zhuǎn)導(dǎo)聯(lián)系緊密，其中NF-κB是重要的轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制之一[19]。NF-κB是p65和p50組成的異源二聚體與IκBα結(jié)合存在于所有細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中并處于失活狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞受到外界某種特殊化學(xué)物質(zhì)的刺激時，IκBα磷酸化而迅速降解，活化反應(yīng)后的分解產(chǎn)物以p50-p65易位狀態(tài)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，與相應(yīng)的應(yīng)答基因啟動子結(jié)合，誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)下游細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β及IL-6等異常表達(dá)，可參與過敏性哮喘發(fā)作的炎癥環(huán)節(jié)。白三烯釋放過量是哮喘的主要原因之一[20]。孟魯司特鈉能夠較好地抑制白三烯合成，有效緩解炎癥反應(yīng)，也能夠有效抑制呼吸道炎癥細(xì)胞的浸潤，緩解氣道的高反應(yīng)性，達(dá)到有效治療哮喘的目的。本研究發(fā)現(xiàn)，哮喘模型組p-p65表達(dá)上調(diào)，IκBα表達(dá)下調(diào)。這表明哮喘大鼠模型中NF-κB通路被異常激活。加入孟魯司特鈉治療后，p-p65表達(dá)下調(diào)，IκBα表達(dá)較哮喘模型組升高，說明NF-κB通路的激活減弱。本研究發(fā)現(xiàn)孟魯司特鈉可以升高IκBα的表達(dá)水平，抑制NF-κB信號通路激活，進(jìn)一步降低下游的炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α釋放，從而起到對支氣管哮喘大鼠的治療作用。

綜上所述，孟魯司特鈉能夠抑制NF-κB信號通路激活，抑制支氣管哮喘大鼠氣道炎癥，減輕呼吸道炎癥細(xì)胞聚集和黏液分泌，降低呼吸道高反應(yīng)性，為今后支氣管哮喘治療及新藥的研發(fā)提供新的參考指標(biāo)和作用靶點。