魏 晴， 陳代鳳， 覃亞雪， 梁珊珊， 孫慶文

（1.貴州中醫(yī)藥大學藥學院，貴州貴陽 550025；2.貴州中醫(yī)藥大學大果木姜子研究中心，貴州貴陽 550025；3.貴州中醫(yī)藥大學植物多糖研究中心，貴州貴陽 550025）

米槁（Cinnamomum migaoH.W.Li）為 樟 科 樟屬植物，多生長于我國西南地區(qū)，以貴州為主。 其干燥成熟果實為大果木姜子， 是貴州十大苗藥之一（貴州省藥品監(jiān)督管理局，2003）。大果木姜子具有溫中散寒，理氣止痛的作用。通常人們把它當作治療胸腹疼痛等疾病的藥物（王軍才等，2015）。近年來對大果木姜子的化學成分和藥理學方面研究比較深入（劉杰和郭江濤，2019；李建銀等，2003）。研究發(fā)現(xiàn)， 大果木姜子中主要成分為黃酮類。 黃酮類化合物具有抗氧化活性， 對自由基的產(chǎn)生有抑制作用， 并且對ROS、RNS 和其他活性物質(zhì)具有清除活性 （Bartekova 等，2018；Xue 等，2017）。由于黃酮類化合物的特定化學結(jié)構(gòu)、 結(jié)構(gòu)內(nèi)的特定取代模式以及擁有能夠充當供氫分子的酚氫，因此， 具有抗氧化活性 （Hana 等，2021；Vladimir等，2020；Monika 等，2020）。 基于此推測大果木姜子發(fā)揮抗氧化作用的部位可能為黃酮組分。

超聲法具有提取速度快、溶劑用量少、提取率高、不影響物質(zhì)活性與化學結(jié)構(gòu)的特點，也是目前實驗室階段使用非常廣泛的一種提取技術(shù)（王曉宏和宋燕，2019）。 響應面法是一種基于三水平二階試驗設計和數(shù)學建模的優(yōu)化方法， 比正交設計更簡化，比均勻設計更全面，可有效減少試驗的次數(shù)，精密度高，預測性能好（徐仕娟等，2021）。 目前， 鮮見有關(guān)大果木姜子黃酮提取工藝及抗氧化活性的研究報道。因此，本試驗以大果木姜子黃酮為研究對象，以提取時間、液料比、超聲功率、乙醇濃度、 超聲溫度為考察因素， 以黃酮含量和對DPPH 清除率為考查指標， 優(yōu)化大果木姜子黃酮最佳提取工藝， 為大果木姜子黃酮類成分的開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 藥材產(chǎn)地為貴州省黔南州羅甸縣壩碰村， 經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學藥學院鑒定為米槁（Cinnamomum migaoH.W.Li）的果實，大果木姜子。

蘆丁標準品（純度＞98%），北京萬佳標準物質(zhì)研發(fā)中心；95%乙醇，分析純，南京化學試劑股份有限公司；DPPH，美國Sigma-Aldrich 公司；其他化學試劑均為分析純試劑。

1.2 儀器與設備 UV7 紫外可見分光光度計（梅特勒-托利多國際貿(mào)易上海有限公司）；HH-600型恒溫水?。ㄉ虾Ｒ豢苾x器有限公司）；FB224 電子分析天平（上海恒平科學儀器有限公司）；KQ-500DE 超聲波清洗儀 （昆山市超聲儀器有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 原料預處理 將新鮮的大果木姜子置于陰涼處晾干，除去枝梗和雜質(zhì)，粉碎，然后過40 目篩，即得大果木姜子粉末，備用。

1.3.2 黃酮提取的單因素試驗

1.3.2.1 提取時間對各指標的影響 分別稱取大果木姜子粉末5 g，按照液料比20：1（mL/g），超聲功率80 W，乙醇濃度70%，超聲溫度60 ℃，提取時間分別為25、30、35、40、45 min 進行提取，考察不同提取時間對各指標的影響。

1.3.2.2 超聲功率對各指標的影響 分別稱取大果木姜子粉末5 g，按照液料比20：1（mL/g），提取時間30 min，乙醇濃度70%，超聲溫度60 ℃，超聲功率分別為20、40、60、80、100 W 進行提取，考察不同超聲功率對各指標的影響。

1.3.2.3 液料比對各指標的影響 分別稱取大果木姜子粉末5 g，按照提取時間30 min，超聲功率80 W，乙醇濃度70%，超聲溫度60 ℃，液料比分別 為10：1、20：1、30：1、40：1、50：1（mL/g）進 行 提取，考察不同液料比對各指標的影響。

1.3.2.4 乙醇濃度對各指標的影響 分別稱取大果木姜子粉末5 g，按照液料比20：1（mL/g），提取時間30 min，超聲功率80 W，超聲溫度60 ℃，乙醇濃度分別為50%、60%、70%、80%、90%進行提取，考察不同乙醇濃度對各指標的影響。

1.3.2.5 超聲溫度對各指標的影響 分別稱取大果木姜子粉末5 g，按照液料比20：1（mL/g），提取時間30 min，超聲功率80 W，乙醇濃度70%，超聲溫度分別為40、50、60、70、80 ℃進行提取，考察不同超聲溫度對各指標的影響。

1.3.3 多評價指標檢測方法

1.3.3.1 黃酮含量測定 黃酮標準曲線的繪制：參考徐仕娟等（2021）的方法繪制標準曲線，得到線性回歸方程為：y=2.2766x-0.0057，R2=0.9997。樣品中黃酮含量的測定： 樣品中黃酮含量的測定也參考徐仕娟等（2021）的方法，黃酮含量計算公式如下：

式中：C 為樣品中黃酮濃度，mg/mL；D 為樣品溶液稀釋倍數(shù)；V表示供試品溶液體積，mL；m為樣品的質(zhì)量，g。

1.3.3.2 抗氧化活性的測定 分別精密吸取各設定條件下提取的大果木姜子黃酮提取液0.2 mL置于10 mL 容量瓶中， 用95%乙醇定容搖勻搖勻。 再分別吸取各樣品2 mL 并加入2 mL DPPH，暗室放置30 min 后在517 nm 下測定吸光度（Ai）， 再分別吸取各樣品2 mL 加入2 mL 95%乙醇，搖勻后測定吸光度（Aj）。此外，吸取2 mL 95%乙醇和2 mL DPPH 于試管中， 快速測定吸光度（A0）。每個樣品測定3 次，取平均值計算各設定條件下提取的大果木姜子黃酮對DPPH 的清除率（ 張 鵬 等，2021；Hana 等，2021；Bartekova 等，2018）。

DPPH 自由基清除率%=［1-（Ai-Aj）/A0］×100。

1.3.4 總評歸一-響應面法優(yōu)化超聲提取工藝參數(shù) 對提取效果進行評價僅僅使用黃酮含量作為評價的指標不足以代表效果的優(yōu)劣，故選用Hassan 的方法對黃酮含量和清除率2 個指標進行歸一化處理（呂明月等，2021；牛曉靜等，2019），2 個指標都是取值越大越好， 計算公式為di=（Yi-Ymin）/（Ymax-Ymin），Ymin 為 指 標 中 最 小 值，Ymax 為指標中最大值。 總評歸一值OD=（d1+d2+d3+…dk）/k（k 為指標數(shù)）。

根據(jù)單因素試驗結(jié)果， 選取對試驗影響較大的因素即提取時間、液料比、超聲功率，以黃酮含量和清除率為評價指標， 并選用OD 值作為響應值進行綜合評分， 采用三因素三水平響應面法對試驗進行設計，設計因素與水平見表1。

表1 試驗因素水平及編碼

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 不同提取時間對大果木姜子黃酮含量和抗氧化活性的影響 由表2 可知， 在固定其他條件下，提取時間在25 ～35 min，隨著提取時間增長，黃酮含量增高， 清除率也越高。 提取時間為35 min 時各指標達到最高值。 40 min 及以后各指標含量略有下降。 這可能是因為隨著提取時間的延長，使得組織細胞破碎程度增加，細胞中其他可溶性雜質(zhì)溶出，導致黃酮含量降低，故抗氧化活性也降低。

表2 不同提取時間對大果木姜子黃酮含量和抗氧化活性的影響

2.1.2 不同超聲功率對大果木姜子黃酮含量和抗氧化活性的影響 由表3 可知， 在固定其他條件下，超聲功率在20 ～60 W，隨著超聲功率增加，黃酮含量增高，清除率也越高。 超聲功率為60 W時各指標達到最高值。 當超聲功率大于60 W 后各指標含量略有下降。 可能是由于超聲功率過大導致黃酮結(jié)構(gòu)被破壞， 同時隨著功率增加體系溫度也會升高， 使得部分熱不穩(wěn)定的黃酮類化合物被分解，導致黃酮含量降低，抗氧化活性降低。

表3 不同超聲功率對大果木姜子黃酮含量和抗氧化活性的影響

2.1.3 不同液料比對大果木姜子黃酮含量和抗氧化活性的影響 由表4 可知，在固定其他條件下，液料比在10：1 ～40：1（mL/g），隨著液料比增長，黃酮含量增高， 清除率也越高。 液料比為40：1（mL/g）時各指標達到最高值。 超過40：1（mL/g）后各指標含量略有下降。 這可能是因為當液料比為40：1 時，溶液中黃酮類物質(zhì)已基本溶出，繼續(xù)增大溶劑量會造成其他可溶性雜質(zhì)成分的溶出，干擾黃酮含量的測定。

表4 不同液料比對大果木姜子黃酮含量和清除率的影響

2.1.4 不同乙醇濃度對大果木姜子黃酮含量和抗氧化活性的影響 由表5 可知，固定其他條件下，乙醇濃度在50% ～70%， 隨著乙醇濃度增加，黃酮含量增高，清除率也越高。 乙醇濃度為70%時各指標達到最高值。當乙醇濃度增多，各指標含量顯著下降。 這是由于高濃度的乙醇會增加溶液的溶解度，使其他可溶性雜質(zhì)被提取出來，故黃酮含量降低，抗氧化活性降低。

表5 不同乙醇濃度對大果木姜子黃酮含量和抗氧化活性的影響

2.1.5 不同提取溫度對大果木姜子黃酮含量和抗氧化活性的影響 由表6 可知， 在固定其他條件下，溫度在40 ～60 ℃，隨著提取溫度升高，黃酮含量增加，DPPH 清除率也越高。 提取溫度為60 ℃時各指標達到最高值，超過60 ℃后各指標含量顯著下降。原因可能隨著提取溫度的升高，使得部分黃酮類化合物結(jié)構(gòu)改變，苯環(huán)被破壞，最終導致黃酮含量降低，抗氧化活性降低。

表6 不同提取溫度對大果木姜子黃酮含量和清除率的影響

2.2 總評歸一-響應面法優(yōu)化超聲提取工藝參數(shù)結(jié)果

2.2.1 試驗設計及結(jié)果 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取對試驗影響較大的因素即提取時間、液料比、超聲功率三個因素，以抗氧化活性、黃酮含量為評價指標，并選用OD 值作為響應值進行綜合評分，采用三因素三水平Box-Behnken 響應面法對試驗進行設計，試驗設計及結(jié)果見表7。

表7 響應面設計及結(jié)果

2.2.2 建立響應面模型擬合及方差分析 采用Design-Expert 8.0.6.1 軟件，以提取時間、液料比、超聲功率為考察因素， 以黃酮含量和抗氧化活性為評價指標，OD 值評分為響應值對試驗結(jié)果進行回歸方程擬合得到回歸方程為：OD 值=0.98+0.046A-0.014B-0.30C +0.044AB-5.984E-003AC+0.019BC-0.28A2-0.33B2-0.34C2（A、B、C 分別代表提取時間、超聲功率、液料比），并對響應面模型進行方差分析及顯著性檢驗，其結(jié)果見表8。

由表8 可知，該模型P＜0.0001，說明此模型差異具有統(tǒng)計學意義， 矯正系數(shù)R2Adj=0.9948，預測復相關(guān)系數(shù)R2=0.9977，預測相關(guān)系數(shù)R2（Pred）=0.9714，與預測復相關(guān)系數(shù)接近，說明偏差在合理范圍內(nèi)，實際值和預測值擬合度比較好。失擬項F=3.752E-003，P=0.0904＞0.05 不顯著， 說明選擇的模型對該試驗的擬合度較好。 變異系數(shù)CV 為4.88%，說明該模型相關(guān)性好，可用該擬合回歸方程對不同條件下大果木姜子黃酮的OD 值進行分析。液料比對大果木姜子黃酮OD 值影響較大，其次為提取時間。由表8 可知，A、C、AB、A2、B2、C2的P＜0.05，以上因素對黃酮OD 值影響顯著，其他因素對黃酮OD 值影響不顯著。 由F 值可知，3 個因素對大果木姜子OD 值影響程度的大小順序為：液料比＞提取時間＞超聲功率。

表8 基于多指標總評歸一評分的回歸模型方差分析及顯著性檢驗

2.2.3 響應面優(yōu)化分析 采用Design-Expert 8.0.6.1 軟件做超聲提取工藝參數(shù)的Box-Behnken響應面3D 圖及等高線分析圖，見圖1，通過其擬合圖形分析提取時間、超聲功率、液料比對OD 值的影響。 由圖可知，等高線越密集，中間形狀呈橢圓形或圓形， 響應曲面越陡峭說明該因素變化對響應值影響大，且兩因素之間的交互作用大，反之表明兩因素之間的交互作用對響應值的影響較小。 結(jié)合表8 的P值和圖1 可知A、C、AB、A2、B2、C2因素對OD 值均具有顯著性（P＜0.05），A 和C對響應面弧面影響較大。 通過求解回歸模型方程得到最佳超聲提取工藝參數(shù)為： 提取時間34.93 min，超聲功率59.37 W，液料比39.67:1（mL/g），此條件下OD 值為0.9847。

圖1 超聲提取工藝參數(shù)的Box-Behnken 響應面3D 圖及等高線分析圖

2.2.4 工藝驗證 為檢驗試驗方法的可靠性，將對優(yōu)化后的工藝參數(shù)進行3 次平行試驗， 同時考慮到優(yōu)化實際操作的可行性， 最終將試驗參數(shù)定為：提取時間35 min，超聲功率60 W，液料比40:1（mL/g）， 得到的OD 均值為0.9910， 與預測值0.9847 相比偏差為0.09%， 說明本試驗所建模型預測性較好且穩(wěn)定。 故基于總評歸一-響應面法優(yōu)化超聲提取工藝參數(shù)的方法可行且穩(wěn)定。

3 結(jié)論

為了更好提取出大果木姜子中黃酮， 僅通過黃酮含量來評價，不足以代表提取工藝的優(yōu)劣，因此采用多指標來評價能夠更加客觀綜合的反映藥材的最優(yōu)提取工藝。 本試驗以黃酮含量、 黃酮對DPPH 清除率為評價指標，超聲功率、提取時間和液料比為考察因素， 采用總評歸一-響應面法對超聲提取工藝的參數(shù)進行優(yōu)化， 得到最佳提取工藝參數(shù)為：提取時間35 min，超聲功率60 W，液料比40：1（mL/g），得到的OD 值為0.9910，黃酮含量為2.48%， 該條件下對DPPH 自由基清除活性為93.18%。本研究為大果木姜子黃酮進一步研究開發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。