郭利亞 ， 趙廣英， 張養(yǎng)東， 張 偉， 白躍宇， 張曉建

（1.河南科技學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453003；2.河南花花牛乳業(yè)集團(tuán)，河南鄭州 450064；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193）

芽孢桿菌是一類在一定條件下能形成芽孢的細(xì)菌。芽孢不是細(xì)菌的繁殖體，是產(chǎn)芽孢菌的內(nèi)生孢子，多呈圓形或橢圓形，含水量低，其也是產(chǎn)芽孢菌的休眠體，具有一定抗逆性，包括抗酸堿、抗輻射、抗壓力等（何國慶等，2019）。 芽孢桿菌來源多、分布廣，奶牛養(yǎng)殖、牛奶儲(chǔ)運(yùn)及加工等過程，都可引起芽孢桿菌污染牛奶，而飼草料、飼用飲水、飼養(yǎng)管理等是主要的污染風(fēng)險(xiǎn)因素。 熱處理是牛奶殺菌的常用方式之一， 是乳品生產(chǎn)中有效保證奶產(chǎn)品安全和延長保質(zhì)期而廣泛采用的一種加工工藝。熱處理主要目的和基本目標(biāo)，是殺死奶中的病原微生物、 大多數(shù)腐敗菌和滅活奶中內(nèi)源性酶或微生物分泌酶等， 確保奶產(chǎn)品品質(zhì)和食用安全（張養(yǎng)東等，2020）。

牛奶的熱處理工藝體系中， 巴氏殺菌和超高溫滅菌，是最常見的兩類熱處理方法。不同熱處理工藝的選擇取決于生乳質(zhì)量、 產(chǎn)品質(zhì)保和質(zhì)量狀態(tài)等要求。通常經(jīng)過高溫滅菌后，奶中的大部分細(xì)菌幾乎都可被殺死，使產(chǎn)品達(dá)到商業(yè)無菌。但李笑坤和殷文政（2014）研究認(rèn)為，如果奶中有芽孢桿菌以芽孢的形式存在， 芽孢耐受高溫滅菌而存活的幾率增大， 存活的芽孢數(shù)量超過商業(yè)無菌的限值，奶產(chǎn)品在環(huán)境條件適合時(shí)，萌發(fā)重新變?yōu)榧?xì)菌繁殖體的可能性增強(qiáng)，進(jìn)而大量生長繁殖，使奶產(chǎn)品產(chǎn)生酸味和腐敗味， 導(dǎo)致奶產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)增加。這不僅影響口感和營養(yǎng)攝入，對(duì)人體健康也會(huì)造成潛在威脅。

1 奶中芽孢桿菌存在特點(diǎn)和危害

1.1 生乳中的芽孢桿菌 生乳產(chǎn)自于奶畜養(yǎng)殖場（區(qū)、戶）或各類牧場，飼草料、飼用飲水、飼養(yǎng)管理等飼源因素， 是生乳中細(xì)菌等微生物一個(gè)主要的污染風(fēng)險(xiǎn)來源。 在細(xì)菌分類中，芽孢桿菌屬、梭狀芽孢桿菌屬、芽孢乳桿菌屬、脫硫胎狀菌屬和芽孢八疊球菌屬為主要的五種產(chǎn)芽孢菌類微生物，其中，前三種較為常見。 在生牛乳中，芽孢桿菌屬檢出率較高，其可分解奶中的營養(yǎng)物質(zhì)，是污染可能性較大的一類產(chǎn)芽孢菌， 也是奶產(chǎn)品生產(chǎn)中重點(diǎn)監(jiān)測的一個(gè)質(zhì)量安全指標(biāo)（任俊琦等，2009）。

生乳中的芽孢桿菌，是形成孢子的主要細(xì)菌，常分離到的幾種芽孢桿菌有地衣芽孢桿菌、 蠟狀芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌等，其中蠟狀芽孢桿菌最為多見（張養(yǎng)東等，2020；何國慶等，2019）。有研究發(fā)現(xiàn)，生牛乳中常溫芽孢數(shù)小于100 cfu/mL，最高可達(dá)1000 cfu/mL，耐高溫芽孢較少，在20 cfu/mL 以下。 在受污染生乳耐熱芽孢菌中，枯草芽孢桿菌檢出率最高，占比30%，蠟樣芽孢桿菌占19%，短小芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、緩慢芽孢桿菌、 栗褐芽孢桿菌分別占11%、8%、8%和3%（龜井俊郎，1996）。 枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌比蠟狀芽孢桿菌耐熱程度大， 牛奶熱處理加工工藝不易完全殺滅， 是引起殺菌或滅菌后奶產(chǎn)品腐敗變質(zhì)一個(gè)重要因素。

1.2 乳制品中的芽孢桿菌 生乳中微生物是影響乳制品貨架期的一個(gè)主要原因，特別是乳品熱處理殺菌不徹底而存留的芽孢桿菌，在一定條件下其可分解巴氏殺菌奶、 發(fā)酵乳等奶產(chǎn)品中的蛋白質(zhì)、脂肪等物質(zhì)，造成營養(yǎng)成分損失，導(dǎo)致奶產(chǎn)品產(chǎn)氣和漲袋（張養(yǎng)東等，2020）。同時(shí)，使奶產(chǎn)品的滋氣味發(fā)生變化， 主要是乳蛋白質(zhì)分解后產(chǎn)生腐敗氣味，脂肪分解產(chǎn)生酸敗味等。 存留在牛奶中的芽孢桿菌，還可利用乳糖產(chǎn)酸，造成甜煉乳等奶產(chǎn)品黏稠度提高，影響產(chǎn)品正常質(zhì)地和狀態(tài)。在滅菌乳制品中，檢出殘留的蠟樣芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌等情況較多。 在乳品生產(chǎn)中，殺菌過程不能完全被殺滅的芽孢桿菌， 貯存過程中條件適宜情況下易激活、繁殖、生長，從而導(dǎo)致奶產(chǎn)品變質(zhì)等質(zhì)量問題。

芽孢桿菌中產(chǎn)毒素菌株的蠟樣芽孢桿菌具有致病性。 蠟樣芽孢桿菌，是一種無莢膜、能運(yùn)動(dòng)、兼性好氧革蘭氏陽性桿菌。 蠟樣芽孢桿菌可產(chǎn)腸毒素，其腸毒素具致吐、致腹瀉危害，誤食蠟樣芽孢桿菌污染的食物，一般短時(shí)間內(nèi)會(huì)出現(xiàn)嘔吐、腹瀉等胃腸道消化系統(tǒng)不適等癥狀（何國慶等，2019；劉紹軍，2006）。 Finlay 等（2000）發(fā)現(xiàn)，蠟樣芽孢桿菌也可導(dǎo)致眼部感染風(fēng)險(xiǎn)，還可引起心內(nèi)膜炎、腦膜炎和菌血癥等疾病。 研究顯示，蠟樣芽孢桿菌已從多種食物中分離到，具有腹瀉型和嘔吐型，并且致腹瀉或嘔吐具有地域性，歐洲、亞洲、美洲等不同地區(qū)各有其主要癥狀特點(diǎn)。 日常飲奶中，由蠟樣芽孢桿菌引起的不適，也可能與乳糖不耐癥有關(guān)（趙月明和任國譜，2014；劉紹軍，2006）。 因此，牛奶中的芽孢桿菌是乳品質(zhì)量安全的一個(gè)重要風(fēng)險(xiǎn)因子，應(yīng)引起生產(chǎn)者、消費(fèi)者、研究者等的重視和警覺。

2 熱處理工藝對(duì)牛奶中芽孢桿菌的影響

熱處理加工工藝是利用適當(dāng)?shù)脑O(shè)施設(shè)備，采用溫度和時(shí)間的不同組合參數(shù)， 對(duì)原料乳進(jìn)行殺菌， 達(dá)到奶產(chǎn)品食用安全的最常用的一種工藝方式。 熱處理?xiàng)l件在理論上一般取決于生乳中微生物的數(shù)量和特性、脂肪或碳水化合物含量等。由于微生物耐熱程度存在差異，不同國家對(duì)奶的熱處理?xiàng)l件工藝要求、規(guī)定或標(biāo)準(zhǔn)不同。巴氏殺菌和超高溫滅菌是最常見的兩種熱處理工藝， 巴氏殺菌熱處理工藝一般采用64 ℃/30 min、75 ～85 ℃/15 s等工藝條件， 超高溫滅菌熱處理工藝通常采用135 ～150 ℃/1 ～4 s 等工藝參數(shù)。巴氏殺菌、高溫殺菌、超高溫滅菌等熱處理工藝不同，所產(chǎn)生的殺菌效果不同，生產(chǎn)的奶產(chǎn)品特性、保質(zhì)期、食用及保存要求等不同， 具體可參見表1 （張養(yǎng)東等，2020； 王加啟等，2017； 張和平和張列兵，2012；Mortier 等，2000）。 由于實(shí)際生產(chǎn)工藝參數(shù)的設(shè)置和日常運(yùn)行受多種因素影響， 要達(dá)到表1 中微生物學(xué)效應(yīng)，熱處理工藝條件必須保證設(shè)置準(zhǔn)確、規(guī)范操作和定期嚴(yán)格校正， 避免引起熱殺菌處理效果的不穩(wěn)定。

表1 不同熱處理?xiàng)l件對(duì)奶產(chǎn)品貯存條件及微生物效應(yīng)的影響

2.1 巴氏殺菌 巴氏殺菌熱處理工藝，能有效殺滅結(jié)核分支桿菌等致病微生物， 通過熱處理降低奶及奶制品中微生物的數(shù)量， 使其對(duì)身體健康不產(chǎn)生危害（Codex Alimentarius Commission，2004）。巴氏殺菌工藝中，若出現(xiàn)熱處理過度，會(huì)對(duì)奶的保存性產(chǎn)生不良影響， 易促使芽孢桿菌產(chǎn)的芽孢發(fā)生熱應(yīng)激而萌發(fā)生長，引起巴氏殺菌奶變質(zhì)，進(jìn)而降低巴氏殺菌奶質(zhì)量和貨架期。 僅就殺菌溫度而言，通常認(rèn)為殺菌溫度小于77 ℃時(shí)，巴氏殺菌奶保存性能較好，乳過氧化物酶可保持活性，不易激活細(xì)菌芽孢生長（張養(yǎng)東等，2020）。

巴氏殺菌能殺死沙門氏菌、空腸彎曲菌、大腸桿菌、單核李斯特菌、腸炎桿菌和布魯氏菌等，但不能殺滅病原菌芽孢 （Kelly 等，2012；Papademas等，2010）。但陳霞等（2011）研究也發(fā)現(xiàn)，巴氏殺菌與超高溫滅菌協(xié)同工藝，經(jīng)85 ℃/15 s 熱處理后，37 ℃保溫2 h，再經(jīng)過135 ℃/4 s 處理，熱致死率達(dá)99%，可有效提高奶中耐熱芽孢的殺滅效率。

實(shí)際生產(chǎn)中， 用于生產(chǎn)巴氏殺菌奶的原料奶中，微生物指標(biāo)有嚴(yán)格限制，一般要求高溫滅菌，這是生產(chǎn)合格巴氏殺菌奶的前提。 蠟狀芽孢桿菌的芽孢在低溫下能夠生長，可引起乳源性疾病。經(jīng)嚴(yán)格巴氏殺菌熱處理的奶不會(huì)引發(fā)疾病， 但如果熱處理不當(dāng)或者在巴氏殺菌后發(fā)生二次污染，奶產(chǎn)品中可能會(huì)出現(xiàn)沙門氏菌、單核李斯特菌等。另外， 巴氏殺菌奶中是否存在嗜冷菌及存在的數(shù)量取決于熱處理前的初始菌數(shù)。因此，原料奶的微生物含量或者生乳的質(zhì)量，是控制奶中微生物，特別是芽孢桿菌的基礎(chǔ)和關(guān)鍵。

2.2 超高溫滅菌 超高溫滅菌是在高溫下對(duì)連續(xù)流動(dòng)的原料奶進(jìn)行一定時(shí)間的熱處理，使產(chǎn)品達(dá)到商業(yè)無菌（Codex Alimentarius Commission，2004），同時(shí)超高溫滅菌和無菌包裝需結(jié)合使用， 滿足儲(chǔ)運(yùn)、攜帶和存放等條件。 超高溫滅菌熱處理的奶產(chǎn)品，在常溫存貯條件下，微生物幾乎不生長。

超高溫滅菌能夠殺滅所有的繁殖性細(xì)菌（病原菌和非病原菌）以及大部分芽孢細(xì)菌，因此，生乳的質(zhì)量是影響超高溫滅菌奶品質(zhì)的關(guān)鍵因素。熱處理對(duì)牛奶中耐熱芽孢致死效果影響表明，耐熱芽孢桿菌最適生長溫度為37 ～42 ℃， 經(jīng)121℃/10 min 和135 ℃/4 s 熱處理后， 熱致死率達(dá)58.08% ～71.43%（陳霞等，2011）。 Scheldeman 等（2006）研究發(fā)現(xiàn)，生乳中芽孢桿菌數(shù)量多，超高溫滅菌處理后易出現(xiàn)殘留風(fēng)險(xiǎn)， 耐熱芽孢桿菌會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)耐熱的芽孢，而Touch 和Deeth（2009）發(fā)現(xiàn)芽孢從管道設(shè)備中徹底清除的難度較大， 導(dǎo)致乳制品生產(chǎn)隱形污染升高， 嚴(yán)重影響后期生產(chǎn)線運(yùn)行和產(chǎn)品品質(zhì)及質(zhì)量。

超高溫滅菌奶中出現(xiàn)的芽孢桿菌， 如嗜熱脂肪芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌， 當(dāng)奶的儲(chǔ)藏溫度低于30 ℃時(shí)處于不生長狀態(tài)，但目前關(guān)于其存在原因是由于滅菌后污染， 還是其耐熱未被殺滅存在一些爭議。在超高溫滅菌奶中，最常檢測到的細(xì)菌有地衣芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、栗褐芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌等， 研究表明蠟樣芽孢桿菌經(jīng)超高溫滅菌處理后不可全被殺滅， 說明存在二次污染的可能，因此生產(chǎn)質(zhì)控管理需引起重視（Touch 和Deeth，2009；Simmonds 等，2003）。

2.3 熱抑菌 在乳品加工中也會(huì)設(shè)置熱抑菌環(huán)節(jié)，也稱預(yù)熱殺菌環(huán)節(jié)。 熱抑菌通常是在60 ～69 ℃條件下保持20 s， 主要目的是抑制細(xì)菌生長或者殺死不耐熱微生物，尤其是嗜冷菌，從而防止產(chǎn)生耐熱的脂肪酶和蛋白酶，影響奶的保存性能。熱抑菌可延長生乳在加工前的貯藏時(shí)間， 提高奶的保存能力（Kelly 等，2012）。 預(yù)熱殺菌與高溫殺菌效果明顯不同， 因其不能完全殺滅單增李斯特菌等奶中的病原菌， 對(duì)牛分枝桿菌等的殺滅作用也有限，在熱抑菌后冷藏期間仍能生長，而無法保證奶的食用安全性（Ozer 和Akdemir，2015）。

2.4 熱協(xié)同高壓滅菌 熱處理對(duì)奶中芽孢桿菌殺菌效果的研究中，不同條件及結(jié)果存在差異，研究發(fā)現(xiàn)熱處理溫度、 保持時(shí)間和超高壓處理相協(xié)同， 對(duì)奶中菌落總數(shù)和大腸菌群有顯著的殺滅效果，這種協(xié)同作用明顯（沈夢琪等，2021；林向陽，2005； 邱偉芬和江漢湖，2001）。 德力格爾桑等（2007）研究了高壓處理對(duì)鮮牛奶中枯草桿菌芽孢的致死效應(yīng)， 結(jié)果顯示，40 ℃條件下200 MPa 低壓處理5 min，停壓1 min，再升至700 MPa 下處理5 min，循環(huán)處理7 次，牛奶中枯草桿菌芽孢數(shù)減少到102～103cfu/mL。 沈夢琪等（2021）研究發(fā)現(xiàn)，生乳在600 MPa（20 ～30 ℃）處理15 min，保溫30 min，菌落總數(shù)的致死率達(dá)100%。 與微生物繁殖體相比，細(xì)菌芽孢對(duì)高壓的耐受能力較強(qiáng)，在1000 MPa 壓力下仍可存活。內(nèi)生孢子對(duì)高壓的耐受能力更強(qiáng)，大于1000 MPa，溫度高于80 ℃條件下才能完全滅活（劉成梅等，2006）。對(duì)熱協(xié)同超高壓不同介質(zhì)中嗜熱脂肪芽孢桿菌的滅活效果研究表明，在60 ～90 ℃條件下，500 ～600 MPa，保壓5 ～30 min， 牛奶中芽孢桿菌的殺滅效果逐漸增強(qiáng)（武玉艷等，2009）。 因此，牛奶熱處理殺菌工藝中，溫度、時(shí)間以及壓力是殺菌效果的關(guān)鍵技術(shù)參數(shù)（Fox 等，2015）。 如果完全殺滅芽孢桿菌，特別是殺死全部可能存在的芽孢，需要溫度、時(shí)間和壓力的有效協(xié)同組合。但郭利亞等（2020）研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)際生產(chǎn)中，多次熱處理、高壓或超高壓、多循環(huán)殺菌處理后，對(duì)牛奶的熱損害程度增大，不良的物理化學(xué)反應(yīng)增強(qiáng)，奶的潛在營養(yǎng)損失提高，與國際通行熱處理工藝路線偏離， 因此該操作的適應(yīng)性仍有待商榷。

3 對(duì)策與建議

生乳或原料奶的品質(zhì)狀況決定牛奶熱處理工藝的選擇（顧佳升等，2016；Fox 等，2015；顧佳升，2004）。而牛奶中的芽孢桿菌數(shù)量也取決于生乳質(zhì)量， 特別是原料奶投料前的質(zhì)控狀態(tài)。 胡啟橋（2000）研究認(rèn)為，如果生乳中芽孢數(shù)過多，熱處理后產(chǎn)品中將會(huì)殘留。因此，控制生乳中芽孢桿菌數(shù)量， 是乳品芽孢桿菌防控的首要關(guān)鍵點(diǎn)（李建洲等，2020）。 特別是來源不能忽視， 芽孢桿菌廣泛存在于自然環(huán)境中，包括土壤、空氣、水和塵埃等，會(huì)污染食品及其原材料。 原料奶的污染來源主要是奶牛的糞便、飼料、水和土壤，還有奶罐和加工車間的機(jī)械管道。 對(duì)于芽孢桿菌， 熱處理工藝只是殺菌的一個(gè)技術(shù)手段， 奶中是否存在芽孢桿菌及存在數(shù)量取決于熱處理前的初始菌數(shù)（李忠民等，2013）。 所以，整個(gè)奶業(yè)生產(chǎn)鏈條運(yùn)行中，需重視養(yǎng)殖場（區(qū)、戶）或牧場作為牛奶生產(chǎn)“第一車間”對(duì)生乳品質(zhì)的影響，特別是飼草料等投入品、飼養(yǎng)技術(shù)及管理、養(yǎng)殖環(huán)境衛(wèi)生等，嚴(yán)格做好飼源因素的有效防控。

生乳中的微生物需要適宜的溫度才能生長，控溫是保持奶中微生物穩(wěn)定和延長貨架期的一個(gè)方法，但牛奶冷卻并在低于4 ℃的條件下儲(chǔ)存，也不能夠抑制所有細(xì)菌的生長繁殖，特別是嗜冷菌，蠟樣芽孢桿菌屬于嗜冷菌且有致病性， 可形成孢子，其多種特性需要引起特別關(guān)注。 另外，目前一些乳品加工企業(yè)，通常只測定原料奶中細(xì)菌總數(shù)，檢測原料奶中芽孢情況較少。對(duì)超高溫滅菌產(chǎn)品，最重要的是原料奶中芽孢總數(shù)及耐熱芽孢數(shù)。 芽孢桿菌及芽孢類別和數(shù)量的測定對(duì)生產(chǎn)具有重要指導(dǎo)意義。

因此，對(duì)于牛奶中芽孢桿菌的防控，飼草料、飼用飲水、飼養(yǎng)管理等飼源性，墊料衛(wèi)生及場區(qū)消毒等飼養(yǎng)環(huán)境源性，冷儲(chǔ)運(yùn)及加工等設(shè)備源性，都需納入防控范圍， 綜合建立防治評(píng)估體系和標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范勢在必行， 同時(shí)建議乳品生產(chǎn)加工企業(yè)建立完善檢驗(yàn)檢測制度，納入產(chǎn)品考核監(jiān)控指標(biāo)，從牧場、工廠到市場全鏈條全面保障，切實(shí)筑牢乳品質(zhì)量安全保護(hù)屏障。