畢旺來，趙巍薇，馬 達(dá)，李 睿,*，周 敏

（1.武漢輕工大學(xué)生命與科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430023；2.武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北 武漢 430023）

沙門氏菌（spp.）是主要的食源性致病菌之一，也是食品污染的常見指示菌，可通過動物性食品、蔬菜及水果等傳播引起人類感染發(fā)病，引發(fā)腸胃炎、菌血癥和傷寒等疾病。據(jù)報道，全球每年有超過1億 人感染沙門氏菌，其中大多數(shù)人會在短期內(nèi)自行恢復(fù)，但也有大約15萬感染者死亡。我國的細(xì)菌性食物中毒有70%～80%是由沙門氏菌引起，抵抗力低下的人群，老年、嬰幼兒尤其容易感染。沙門氏菌造成的食品安全問題在我國很常見。在不發(fā)達(dá)地區(qū)或者農(nóng)村地區(qū)，由于當(dāng)?shù)厝嗣裥l(wèi)生意識差，由聚餐引發(fā)的沙門氏菌食物中毒事件屢見報端。

除此之外，沙門氏菌的耐藥現(xiàn)象也很嚴(yán)重。近年來，全國各地屢屢從雞蛋、水產(chǎn)品、禽肉制品等食物中分離到多重耐藥沙門氏菌，對食品安全防控造成了嚴(yán)重威脅。沙門氏菌耐藥機(jī)制復(fù)雜，主要涉及滅活酶及鈍化酶的產(chǎn)生、基因突變、細(xì)菌主動外排作用、可移動基因元件介導(dǎo)和生物膜的形成等，這些機(jī)制相互作用共同決定沙門氏菌的耐藥水平。由于抗生素濫用、細(xì)菌耐藥基因水平傳播等原因，加劇了食品中耐藥性致病菌的潛在風(fēng)險。2020年11月20日，多個聯(lián)合國機(jī)構(gòu)共同宣布成立一體化衛(wèi)生抗微生物藥物耐藥性領(lǐng)導(dǎo)人小組，以促進(jìn)全球重視并采取行動，避免微生物耐藥性造成的災(zāi)難性后果。

喹諾酮類藥物是人畜通用的抗生素，包括第1代藥物萘啶酸，第3代藥物環(huán)丙沙星，第4代藥物莫西沙星等。喹諾酮類耐藥主要由喹諾酮耐藥決定區(qū)（quinolone resistance-determining region，QRDR）基因突變導(dǎo)致。喹諾酮類藥物的作用靶位為DNA促旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶IV，前者由2個GyrA亞基和2個GyrB亞基組成，分別由和基因編碼；后者由2個ParC亞基和2個ParE亞基組成，分別由和基因編碼。DNA促旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶IV的QRDR發(fā)生氨基酸突變可引起酶的結(jié)構(gòu)與功能改變，影響喹諾酮類藥物與靶位的結(jié)合，降低細(xì)菌對喹諾酮類藥物的敏感性，從而導(dǎo)致耐藥菌株的出現(xiàn)。此外質(zhì)粒上的喹諾酮類耐藥（plasmid mediated quinolone resistance，PMQR）基因也可介導(dǎo)喹諾酮類耐藥，PMQR基因主要是編碼Qnr蛋白的基因。

鑒于細(xì)菌耐藥性日趨嚴(yán)重的現(xiàn)實，查明喹諾酮類耐藥株QRDR和PMQR狀況，有助于更好地了解沙門氏菌耐藥性的產(chǎn)生和傳播途徑，為預(yù)防和控制沙門氏菌提供理論依據(jù)。目前國內(nèi)外對耐藥基因突變的研究還是以基因測序為主，耗費(fèi)大、時間長?；谝陨媳尘?，本實驗篩查食源性沙門氏菌喹諾酮類耐藥株P(guān)MQR分布狀況，并設(shè)計一種real-time PCR方法，結(jié)合全基因組測序方法對QRDR突變進(jìn)行real-time PCR檢測和測序驗證。本實驗結(jié)果將為耐藥基因突變位點(diǎn)篩查提供新的準(zhǔn)確快捷的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

大腸桿菌（）ATCC25922、沙門氏菌（）ATCC14028，神農(nóng)架林區(qū)檢驗檢測中心提供。120 株待檢食源性沙門氏菌分離株2017—2020年間分離獲得，其中92 株分離自江西南昌市冰凍禽肉制品，28 株分離自神農(nóng)架林區(qū)冰凍禽肉制品。

細(xì)菌基因組提取試劑盒（TIANamp bacteria DNA Kit離心柱型） 天根生化科技有限公司；Gold view核酸染料 北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司；2×realtime PCR Mix 武漢楚誠正茂生物工程有限公司；PCR產(chǎn)物純化試劑盒、DNA Marker 2000、TaKaRa試劑盒寶生物（大連）有限公司；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

DYY-10C電泳儀 北京六一儀器廠；恒溫培養(yǎng)箱上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；梯度PCR儀 德國Biometra公司；臺式高速冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司；ABI7500型熒光定量PCR儀 美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；GBox-HR-E-M凝膠圖像系統(tǒng) 英國Syngene公司。

1.3 方法

1.3.1 藥敏實驗

采用藥敏紙片擴(kuò)散法（K-B法）測定細(xì)菌藥物敏感性，參考2018年臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）的《抗菌藥物敏感性試驗執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)》進(jìn)行。即用無菌棉拭子蘸取菌液，涂布MH平板表面。用無菌鑷子將萘啶酸（5 μg/片）、環(huán)丙沙星（5 μg/片）藥敏紙片貼在瓊脂表面。紙片貼完15 min內(nèi)，將平板倒置于37 ℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)16～18 h。測量各個藥敏紙片的抑菌圈直徑。用大腸桿菌ATCC25922作質(zhì)控株同步做質(zhì)量控制。將各抗生素藥敏紙片的抑菌圈直徑與CLSI標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比對，報告待測細(xì)菌對該抗生素是否敏感（S）、中介（I）或耐藥（R）。

1.3.2 全基因組二代測序

選取4 株南昌來源食源性沙門氏菌，菌株編號為3、4、31、62。將菌液制備成甘油管送上海美吉生物公司，采用Illumina HiSeq X-10平臺進(jìn)行二代測序、序列組裝和基因功能注釋。對4 株菌耐藥基因進(jìn)行深入挖掘。采用抗生素耐藥基因數(shù)據(jù)庫（http://arpcard.Mcmaster.ca，Version 1.1.3）和Resfinder 4.1（https://cge.cbs.dtu.dk/services/ResFinder/）對耐藥基因進(jìn)行搜索預(yù)測。

1.3.3 細(xì)菌核酸提取

將細(xì)菌用LB培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)過夜，用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取DNA。提取的DNA利用超微量分光光度儀測定DNA的含量，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4基因PCR篩查

PCR擴(kuò)增檢測、、，引物參照文獻(xiàn)[17]合成，序列見表1。PCR擴(kuò)增體系（25 μL）為：DNA模板1 μL，上游引物和下游引物（10 μmol/L）各1 μL，TaKaRa r酶0.15 μL，10×Buffer 2.5 μL，dNTPMix（2.5 mmol/L）2 μL，ddHO補(bǔ)足總反應(yīng)體系到25 μL。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，預(yù)定溫度退火45 s，72 ℃延伸1 min，32個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。其中、退火溫度為53 ℃，退火溫度為55 ℃。擴(kuò)增得到的產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察產(chǎn)物片段大小進(jìn)行驗證?；虍a(chǎn)物大小516 bp；基因產(chǎn)物大小417 bp；基因產(chǎn)物大小469 bp。

表1 qnr基因PCR檢測引物Table 1 PCR primers for qnr gene

1.3.5 real-time PCR引物設(shè)計

將4 株測序的沙門氏菌進(jìn)行序列組裝后，分析、基因序列及基因突變位點(diǎn)的信息，食源性沙門氏菌包含有4個常見的突變位點(diǎn)，分別為Asp87Tyr，核苷酸GAC→TAC；Asp87Asn，核苷酸GAC→AAC；Thr57Ser，核苷酸ACC→AGC；Ser80Ile，核苷酸AGC→ATC。使用在線軟件對4個突變位點(diǎn)設(shè)計特異性引物（http://cedar.genetics.soton.ac.uk/public_html/primer1.Html）。上游引物3’末端為待檢驗的突變位點(diǎn)，用下劃線標(biāo)識。為提高引物特異性，在上游序列靠近3’末端人為引進(jìn)堿基錯配，以減少引物和模板間形成的二級結(jié)構(gòu)自由能值。堿基錯配也用下劃線標(biāo)識。引物序列見表2。

表2 基因突變位點(diǎn)real-time PCR檢測引物Table 2 Real-time PCR primers for mutation sites

1.3.6 real-time PCR擴(kuò)增

對提取得到的沙門氏菌基因組DNA分別進(jìn)行Asp87Tyr、Asp87Asn、Thr57Ser和Ser80Ile四個位點(diǎn)real-time PCR擴(kuò)增篩查，以不含以上突變位點(diǎn)ATCC14028菌株作為陰性對照，以含有上述突變位點(diǎn)的測序菌株作為陽性對照。擴(kuò)增結(jié)束后查看熔解曲線和擴(kuò)增曲線。預(yù)實驗中擴(kuò)增得到的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察產(chǎn)物片段大小。根據(jù)4個位點(diǎn)設(shè)計的real-time PCR引物見表2。

PCR體系（25 μL）：DNA模板1 μL、上游引物和下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL、2×SYBR Green realtime PCR Mix 12.5 μL、ddHO 10.5 μL。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性10 s，預(yù)定溫度退火15 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)。Asp87Tyr位點(diǎn)檢測的退火溫度為56.2 ℃，Asp87Asn位點(diǎn)檢測的退火溫度為55.5 ℃，Thr57Ser位點(diǎn)檢測的退火溫度為61.6 ℃，Ser80Ile位點(diǎn)檢測的退火溫度為56.8 ℃。

1.3.7 QRDR位點(diǎn)的測序驗證

將待驗證的10 株沙門氏菌分別進(jìn)行、基因全長擴(kuò)增，上游引物為CGCCTACTTAAACTACTCCA，下游引物為GCCGACCACCTTCTGTA；上游引物為TGCCCGTGTCGTTGGT，下游引物為GTCGCACGAGACTTGG。

PCR擴(kuò)增體系（25 μL）為：DNA模板1 μL，上游引物和下游引物（10 μmol/L）各1 μL，TaKaRa r酶0.1 μL，10×Buffer 2.5 μL，dNTPMix（2.5 mmol/L）2 μL，ddHO 17.4 μL。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，32個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，然后用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化，送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行雙向測序驗證QRDR位點(diǎn)。將測序原始數(shù)據(jù)采用DNASTAR軟件進(jìn)行拼接，查找并驗證real-time PCR檢測出來的QRDR位點(diǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 喹諾酮類藥物敏感性實驗和qnr基因篩查

藥敏實驗結(jié)果證實，120 株食源性沙門氏菌分離株有45 株菌耐喹諾酮類抗生素萘啶酸，其中11 株來源于神農(nóng)架，34 株來源于江西南昌。3 株神農(nóng)架株、8 株南昌株同時耐環(huán)丙沙星，環(huán)丙沙星耐藥率分別為10.7%（3/28）、8.7%（8/92）。神農(nóng)架株對喹諾酮類藥物耐藥率為39.3%（11/28），南昌株對喹諾酮類藥物耐藥率為37%（34/92）。兩地菌株喹諾酮類藥物耐藥率非常接近。

將4 株南昌株送樣進(jìn)行二代測序，序列組裝、基因功能注釋后進(jìn)行耐藥基因檢測，結(jié)果僅4號菌株檢出攜帶基因，未檢出其他亞型。以余下的41 株喹諾酮耐藥沙門氏菌為研究對象，PCR篩查喹諾酮耐藥基因、、。圖1、2為部分沙門氏菌DNA提取和基因檢測PCR產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果。南昌株有8 株P(guān)CR檢出耐藥基因，檢出率為23.5%（8/34）；神農(nóng)架株有6 株檢出耐藥基因，檢出率為54.4%（6/11）。而、耐藥基因檢出率均為0%。

圖1 沙門氏菌總DNA電泳結(jié)果Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of total DNA extracted from Salmonella isolates

圖2 qnrS基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig. 2 PCR amplification products of qnrS gene

2.2 real-time PCR擴(kuò)增檢測gyrA和parC基因突變

對本課題組測序的4 株南昌株進(jìn)行QRDR位點(diǎn)分析。通過與Resfinder數(shù)據(jù)庫比對，發(fā)現(xiàn)4 株沙門氏菌和沒有突變位點(diǎn)，但和基因均有數(shù)個QRDR突變位點(diǎn)。其中有4個突變位點(diǎn)是文獻(xiàn)常報道的QRDR位點(diǎn)。除了測序的3號菌不含有上述4個QRDR位點(diǎn)，4號菌攜帶Thr57Ser突變，31號菌攜帶Asp87Tyr突變，62號菌同時攜帶Thr57Ser+Ser80Ile+Asp87Asn突變。

根據(jù)這4個QRDR位點(diǎn)設(shè)計real-time PCR檢測引物。經(jīng)過PCR篩查，45 株耐喹諾酮的沙門氏菌中有31 株未檢出基因，推斷這些菌株和基因應(yīng)存在QRDR位點(diǎn)突變，從而導(dǎo)致喹諾酮耐藥。因此對這31 株菌采用real-time PCR法檢測和基因QRDR位點(diǎn)。

real-time PCR檢測的熔解曲線圖和擴(kuò)增曲線見圖3～6。樣品熔解曲線均形成單一峰，說明無非特異性擴(kuò)增。樣品real-time PCR擴(kuò)增Ct值在16～28之間，擴(kuò)增效率良好。陰性對照Ct值大于35，說明real-time PCR無污染，無假陽性。二代測序的4 株菌進(jìn)行real-time PCR檢測后，根據(jù)測序所得和基因QRDR位點(diǎn)，與realtime PCR結(jié)果進(jìn)行分析比對，結(jié)果表明這4個菌real-time PCR擴(kuò)增結(jié)果和測序結(jié)果吻合，說明real-time PCR特異性良好。

圖3 real-time PCR檢測parC Thr57Ser突變位點(diǎn)Fig. 3 Real-time PCR detection of parC Thr57Ser

圖4 real-time PCR檢測parC Ser80Ile突變位點(diǎn)Fig. 4 Real-time PCR detection of parC Ser80Ile

圖5 real-time PCR檢測gyrA Asp87Asn突變位點(diǎn)Fig. 5 Real-time PCR detection of gyrA Asp87Asn

圖6 real-time PCR檢測gyrA Asp87Tyr突變位點(diǎn)Fig. 6 Real-time PCR detection of gyrA Asp87Tyr

表3 31 株沙門氏菌基因突變位點(diǎn)檢測結(jié)果Table 3 Gene mutation sites of 31 Salmonella isolates

如表3所示，31 株沙門氏菌除2 株未檢出QRDR突變外，其他菌株均有檢出。其中Thr57Ser+Asp87Asn型突變最常見，菌株檢出數(shù)目最多。

為進(jìn)一步驗證real-time PCR的準(zhǔn)確性，挑選10 株real-time PCR陽性菌株分別擴(kuò)增和全長，純化后送生物公司雙向測序。部分PCR產(chǎn)物如圖7所示。將測序數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接比對，找尋和基因突變位點(diǎn)，測序結(jié)果與real-time PCR結(jié)果高度吻合，進(jìn)一步證實了realtime PCR的可靠性。

圖7 parC、gyrA基因全長PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig. 7 PCR amplification of the complete sequences of parC and gyrA

3 討 論

沙門氏菌耐藥日益嚴(yán)重，相對于其他抗生素類藥物，沙門氏菌對喹諾酮類藥物敏感性相對較高。本實驗發(fā)現(xiàn)因此喹諾酮類三代藥物如環(huán)丙沙星仍是沙門氏菌感染治療的推薦藥物之一。

沙門氏菌對喹諾酮類耐藥主要由QRDR突變和PMQR介導(dǎo)引起。目前基因單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）的檢測方法可以分為兩類：一類是以單鏈構(gòu)象多態(tài)性、等位基因特異性PCR等為代表的以凝膠電泳為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)方法。另一類是以直接測序、變性高效液相色譜、高分辨率溶解曲線等為代表的高通量檢測方法。近年來部分學(xué)者研發(fā)了一些篩查QRDR突變的新技術(shù)，比如單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析、變性高效液相色譜、高分辨率溶解曲線法等。這些技術(shù)操作要求高，費(fèi)用高，而且主要是檢測已知的基因突變位點(diǎn)。目前多數(shù)文章研究QRDR突變采取的還是基于測序的方法。Takashi等采取Illumina平臺二代測序方式研究了107 株傷寒沙門氏菌QRDR突變，識別出2 461個SNP位點(diǎn)。其中高耐藥菌含有3個QRDR突變，Ser83Phe、Asp87Asn和Ser80Ile。游興勇等采取二代全基因組測序分析了2018年江西省臨床分離的58 株非傷寒沙門菌，這些菌存在不同程度的QRDR突變。其中突變率最高（31.03%,18/58），且全部是Thr57Ser突變，其次是（27.59%，16/58）突變，最常見的有Asp87Asn（4 株）和Asp87Tyr（8 株）突變。葛琨等采取測序的方法研究了30 株烏魯木齊牛羊肉源沙門氏菌QRDR基因突變狀況，發(fā)現(xiàn)14 株沙門氏菌發(fā)生Ser83Phe基因突變，25 株發(fā)生了Thr57Ser基因突變。劉貴深等發(fā)現(xiàn)16 株耐環(huán)丙沙星沙門氏菌常見突變類型是Ser83Phe和Asp87Gly變異，同時伴隨Ser80Arg變異。

以上文獻(xiàn)結(jié)果與本實驗有很多相似之處，也有不同之處，比如發(fā)現(xiàn)2 株南昌株攜帶了Ser80Ile突變。游興勇等研究的58 株南昌臨床株均未發(fā)現(xiàn)該突變。本實驗發(fā)現(xiàn)Thr57Ser和Asp87Asn很常見，南昌株有22 株發(fā)生Thr57Ser突變，15 株發(fā)生Asp87Asn突變，這個結(jié)果和游興勇等的研究相似。在本實驗中，120 株沙門氏菌中有45 株對萘啶酸耐藥，其中僅14 株菌檢出基因。所有沙門氏菌均未檢出、兩種亞型。游興勇等發(fā)現(xiàn)58 株江西來源臨床株P(guān)MQR基因攜帶率最高為（29.31%，17/58），有3 株菌檢出（5.17%，3/58）。這一結(jié)果和本實驗不同。沙門氏菌耐藥狀況復(fù)雜，因此耐藥株來源、分離時間、樣本數(shù)量等，都會對研究結(jié)果造成一定影響。

本實驗沒有對陽性的菌株進(jìn)行real-time PCR檢測，有的文獻(xiàn)報道部分沙門氏菌菌株同時具有QRDR和PMQR，如果加上這部分菌株，發(fā)生QRDR突變的菌株檢出率會更高。此外QRDR突變比較復(fù)雜多樣，比如經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)3號菌株雖然沒有Asp87Tyr、Asp87Asn、Thr57Ser和Ser80Ile這4個文獻(xiàn)常報道的QRDR突變，但具有Thr748Met、Thr255Ser、Asn395Ser、Ala620Thr和Ser469Ala突變。這些突變是否能影響菌株對喹諾酮藥物的敏感性尚需驗證。

在耐藥機(jī)制研究上全基因組測序具有較大的優(yōu)勢，可識別新的耐藥基因及其突變。但單純采用全基因組測序的方法跟蹤研究耐藥基因費(fèi)用昂貴、時間長。本實驗建立了一種real-time PCR的方法檢測QRDR突變。對31個無PMQR的喹諾酮耐藥株篩查Asp87Tyr、Asp87Asn、Thr57Ser和Ser80Ile這4個文獻(xiàn)常報道的QRDR突變，采取已經(jīng)二代測序的4 株菌作為對照，并隨機(jī)挑選有real-time PCR陽性產(chǎn)物的10個菌擴(kuò)增基因和基因全長，結(jié)果這14個菌的realtime PCR結(jié)果和測序結(jié)果完全吻合。說明本實驗建立的real-time PCR方法特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確可靠。采取本實驗的引物設(shè)計思路還可以建立篩查其他各種耐藥基因突變的real-time PCR方法。采用全基因組測序和real-time PCR聯(lián)用的方法既可以發(fā)現(xiàn)新的耐藥基因及其突變，又可以篩查大量的樣本，成本低、耗時短。

沙門氏菌耐藥機(jī)制復(fù)雜，目前全球處于新冠后疫情時代，各地大規(guī)模消毒可能會誘導(dǎo)環(huán)境中細(xì)菌產(chǎn)生新的耐藥性。因此對環(huán)境-食品-人這一鏈條上細(xì)菌耐藥性變化的監(jiān)控力度應(yīng)該加大。全基因組測序結(jié)合realtime PCR檢測，可應(yīng)用于跟蹤細(xì)菌耐藥基因突變的研究，更快的識別新出現(xiàn)的耐藥危害，有助于及時制定公共衛(wèi)生的風(fēng)險控制策略。