黃永橋，宋光林，毛敏霞，楊昌彪，馬 凱，高 亮,*

（1.貴州省檢測(cè)技術(shù)研究應(yīng)用中心，貴州 貴陽(yáng) 550016；2.貴州省分析測(cè)試研究院，貴州 貴陽(yáng) 550016）

畜牧業(yè)的發(fā)展與各種藥物密切相關(guān)，這些藥物被廣泛用于預(yù)防或控制疾病，以增加肉類產(chǎn)量，降低成本?？拐婢幬锸侵匾囊活愃幬?，常用于治療由煙曲霉、白色念珠菌和新生隱球菌等真菌引起的各種疾病。抗真菌藥物根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)可分為棘白菌素類、多烯類、嘧啶類、丙烯胺類及烯丙基胺衍生物等。

研究表明，抗真菌藥物并不完全安全，如唑類抗真菌藥物具有一定的肝毒性，并對(duì)腎上腺和性腺有一定的抑制作用；灰黃霉素具有一定的神經(jīng)毒性、肝毒性、致癌性及致畸作用等。因此，新抗真菌藥物的研究與開(kāi)發(fā)主要考慮對(duì)現(xiàn)有藥物的毒性降低、提高藥效為目的的劑型改良和結(jié)果修飾。由于濫用藥物或沒(méi)有嚴(yán)格遵守藥物安全間隔期導(dǎo)致藥物或其代謝物殘留，會(huì)對(duì)人體健康產(chǎn)生影響，增加消費(fèi)者的潛在風(fēng)險(xiǎn)。因此，加強(qiáng)畜產(chǎn)品中該類藥物殘留量的檢測(cè)必不可少，建立畜產(chǎn)品中抗真菌藥物殘留量的檢測(cè)方法具有重要意義。

目前，有關(guān)抗真菌藥物測(cè)定的方法主要有高效液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。液相色譜法靈敏度較低、選擇性較差；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）法因具有較高的靈敏度、選擇性和抗干擾能力，被廣泛用于痕量化合物分析方法中。張凱等采用QuEChERS dSPE EMR-Lipid凈化管的前處理方法，建立了測(cè)定羊肉中8種抗真菌藥物的UPLC-MS/MS快速檢測(cè)方法；邵明媛和蔡永通等采用乙二胺--丙基硅烷（primary secondary amine，PSA）吸附劑的前處理方法，建立了測(cè)定化妝品中抗真菌藥物的UPLC-MS/MS快速檢測(cè)方法。然而應(yīng)用QuEChERS結(jié)合UPLC-MS/MS法針對(duì)多種畜肉（豬肉、牛肉、羊肉）中抗真菌藥物殘留的檢測(cè)技術(shù)罕見(jiàn)報(bào)道，且缺乏相關(guān)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，已發(fā)布的標(biāo)準(zhǔn)及法規(guī)對(duì)抗真菌藥物在畜肉中的最大殘留限量也未作規(guī)定。因此，建立高通量超痕量的快速檢測(cè)技術(shù)，對(duì)畜肉中抗真菌藥物殘留的檢測(cè)方法技術(shù)進(jìn)行研究顯得非常必要。QuEChERS法作為新開(kāi)發(fā)的一種快速、簡(jiǎn)便、低成本且環(huán)境友好的前處理方法，被廣泛用于農(nóng)獸藥殘留測(cè)定、非法添加藥物測(cè)定及污染物測(cè)定等方面。

本研究以豬肉、牛肉和羊肉為研究對(duì)象，采用QuEChERS法進(jìn)行前處理，結(jié)合UPLC-MS/MS儀，對(duì)樣品前處理?xiàng)l件和儀器條件進(jìn)行優(yōu)化，建立QuEChERS結(jié)合UPLC-MS/MS的分析方法，并對(duì)建立的方法進(jìn)行方法學(xué)評(píng)價(jià)。該方法可用于畜肉中8種抗真菌藥物殘留量的快速定性和定量分析，為食品安全監(jiān)管提供強(qiáng)有力的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肉、牛肉和羊肉 貴州貴陽(yáng)各大型超市及農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；甲醇、乙腈（均為色譜純） 德國(guó)Merck公司；乙腈、乙酸乙酯、無(wú)水硫酸鈉（均為分析純） 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；甲酸（色譜純）、十八烷基鍵合硅膠C吸附劑（40～63 μm）、PSA吸附劑（40～63 μm） 上海安普實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；QuEChERS dSPE EMR-Lipid凈化管 美國(guó)Agilent公司；Oasis PRiME HLB固相萃取小柱 美國(guó)Waters公司；陶瓷均質(zhì)子 北京迪馬科技有限公司；8種抗真菌藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（純度＞98%，100 μg/mL灰黃霉素、克霉唑、咪康唑、益康唑、聯(lián)苯芐唑、酮康唑、氟康唑、萘替芬） 天津阿爾塔科技有限公司；0.22 μm PTFE濾膜上海安普實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

6470三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（配有電噴霧離子源）、1290 UPLC儀 美國(guó)Agilent公司；Blixer3攪拌機(jī)法國(guó)Robot Coupa公司；LT2002電子天平 常熟市天量?jī)x器有限公司；UMV-2多管渦旋混合器 北京普立泰科儀器有限公司；L-550離心機(jī) 湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；Milli-Q超純水機(jī) 美國(guó)Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

從100 μg/mL 8種抗真菌藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中準(zhǔn)確移取1.00 mL于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解并定容刻度，混勻，配制成質(zhì)量濃度為10.0 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-18 ℃避光保存。移取100.0 μL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈定容，配制成100 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。移取1.0 mL 100 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈定容，配制成10 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，備用。

舉個(gè)例子，比如說(shuō)我有一輛車，但是這輛車我不經(jīng)常使用，大部分時(shí)間這輛車的價(jià)值沒(méi)有得到體現(xiàn)，這是資源的浪費(fèi)。那么，如何把這輛車的資源充分的利用起來(lái)呢？——“共享”給有需求的人。這樣一來(lái)，資源得到利用，我作為供給方也獲得一定的收益。久而久之，供不應(yīng)求，第三方電子商務(wù)企業(yè)就會(huì)提供給司機(jī)更多的需求客源，這就是共享經(jīng)濟(jì)。這些平臺(tái)，就是我們現(xiàn)在所熟知的打車軟件——“滴滴出行”。

1.3.2 樣品前處理

稱取搗碎后的組織樣品5.00 g于50 mL具塞離心管中，準(zhǔn)確加入10 mL 0.1%甲酸-乙腈，加入1 粒陶瓷均質(zhì)子，渦旋振蕩10 min，4 500 r/min常溫離心10 min，吸取2 mL上清液于預(yù)先加有500 mg無(wú)水硫酸鈉和25 mg C吸附劑的離心管中，渦旋1 min，5 000 r/min離心2 min，取上清液過(guò)0.22 μm PTFE濾膜，待測(cè)。

1.3.3 儀器條件

1.3.3.1 色譜條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus-C反相色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相：A為0.1%甲酸溶液，B為乙腈；流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：5.0 μL；梯度洗脫程序：0～0.5 min，90% A、10% B；0.5～0.6 min，90%～54% A、10%～46% B；0.6～4.5 min，54%～48% A、46%～52% B；4.5～4.6 min，48%～10% A、52%～90% B；4.6～5.5 min，10% A、90% B；5.5～5.51 min，10%～90% A、90%～10% B；5.51～7 min，90% A、10% B。

1.3.3.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源，正離子掃描模式；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；毛細(xì)管電壓：4.0 kV；霧化器壓力：40 psi；干燥氣流速：10 L/min；干燥氣溫度：300 ℃；鞘氣流速：10 L/min；鞘氣溫度：300 ℃。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及圖表繪制

所有數(shù)據(jù)均在Agilent MassHunter Data Acquisition軟件下采集，采用Qualitative Analysis Navigator B.08.00定性軟件、Quantitative Analysis B.09.00定量軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理；圖表繪制采用Excel 2016和Origin 2018版。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理的優(yōu)化

2.1.1 提取

乙腈和乙酸乙酯作為常用提取溶劑，對(duì)多數(shù)化合物有較好的提取效率，降低提取溶劑的pH值能破壞樣品的組織結(jié)構(gòu)，使目標(biāo)物從組織中游離出來(lái)，加快提取效率。本實(shí)驗(yàn)比較乙腈、0.1%甲酸-乙腈、乙酸乙酯和0.1%甲酸-乙酸乙酯作為提取溶劑時(shí)對(duì)8種抗真菌藥物的提取效率，結(jié)果見(jiàn)圖1。乙酸乙酯和0.1%甲酸-乙酸乙酯對(duì)酮康唑回收率為0%，對(duì)氟康唑、聯(lián)苯芐唑、灰黃霉素和咪康唑的提取效率均不理想（回收率均＜45%），對(duì)萘替芬和克霉唑的提取效率較差（回收率＜55%），益康唑的提取效率滿足要求（回收率＞75%）。乙腈和0.1%甲酸-乙腈對(duì)8種抗真菌藥物的提取效果較好（回收率均＞70%），且0.1%甲酸-乙腈的提取效果略優(yōu)于乙腈，因此，選擇0.1%甲酸-乙腈作為樣品提取溶劑。

渦旋振蕩提取能使溶劑與樣品基質(zhì)充分混合，實(shí)驗(yàn)考察渦旋振蕩提取時(shí)間（5、10、15 min）對(duì)提取效率的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在5～10 min時(shí)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)提取效果明顯增大，10 min以后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，提取效果基本趨于穩(wěn)定，故選用渦旋振蕩10 min作為樣品提取時(shí)間。

圖1 提取溶劑對(duì)8種抗真菌藥物回收率的影響（n=3）Fig. 1 Effects of different extraction solvents on the recovery of eight antifungal drugs (n = 3)

2.1.2 凈化

畜肉中含有較多的脂肪、色素和磷脂等雜質(zhì)，凈化時(shí)需盡可能多的去除雜質(zhì)干擾，又要減少對(duì)目標(biāo)物的損失。QuEChERS法處理快速簡(jiǎn)單，常用的吸附劑有C、PSA、GCB等。PSA可吸附金屬離子、色素、脂肪酸和其他極性有機(jī)酸等雜質(zhì)，C可以吸附脂肪等弱極性雜質(zhì)。本研究對(duì)QuEChERS dSPE EMR-Lipid凈化管、Oasis PRiME HLB固相萃取小柱（無(wú)須活化、淋洗及洗脫等步驟，可快速吸附雜質(zhì)）、PSA及C吸附劑進(jìn)行了考察（圖2A）。結(jié)果表明，使用Oasis PRiME HLB固相萃取小柱時(shí)，除氟康唑（11%）和益康唑（56%）有較小回收率外，對(duì)其他目標(biāo)物吸附性很強(qiáng)；使用PSA吸附劑時(shí)，除氟康唑（59%）、酮康唑（63%）和咪康唑（68%）回收率較差，其他目標(biāo)化合物回收率均大于74%；QuEChERS dSPE EMR-Lipid凈化管及C吸附劑對(duì)目標(biāo)物均有較好的回收率，C吸附劑的回收率、雜質(zhì)干擾及基線噪聲等均優(yōu)于QuEChERS dSPE EMR-Lipid凈化管。因此，選取C吸附劑進(jìn)行凈化。

研究進(jìn)一步對(duì)C吸附劑用量（25、50、100 mg）進(jìn)行考察。如圖2B所示，除益康唑的回收率隨C吸附劑的用量增加而增大外，其余指標(biāo)的回收率均隨C吸附劑的用量增加而變小，故選用25 mg C吸附劑凈化樣品。QuEChERS凈化方法通常加入一定量的吸水劑，促進(jìn)目標(biāo)化合物由水相分配至有機(jī)相。此研究對(duì)無(wú)水硫酸鈉的用量一并進(jìn)行了研究，最終確定無(wú)水硫酸鈉的使用量為500 mg。綜合考慮，使用500 mg無(wú)水硫酸鈉和25 mg C吸附劑作為樣品凈化方法。

圖2 不同凈化方法（A）和C18吸附劑用量（B）對(duì)回收率的影響（n=3）Fig. 2 Effects of different purification methods (A) and the amount of C18 adsorbent (B) on the recovery of eight antifungal drugs (n = 3)

2.2 色譜條件的優(yōu)化

8種抗真菌藥物化學(xué)結(jié)構(gòu)差異大，化學(xué)性質(zhì)不同，本實(shí)驗(yàn)采用UPLC，選擇ZORBAX Eclipse Plus-C色譜柱對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行分離。流動(dòng)相中加入甲酸可以增加色譜柱的保留能力，提高分離效果。分別考察50 mm和100 mm的色譜柱，以及乙腈、甲醇、0.1%甲酸溶液、0.1%甲酸溶液含2 mmol/L乙酸銨溶液等不同洗脫體系的分離能力。結(jié)果表明，使用100 mm的色譜柱各化合物分離度更好；使用乙腈-0.1%甲酸溶液作為流動(dòng)相時(shí)，目標(biāo)物有良好的色譜分離效果，有較好的響應(yīng)值。進(jìn)一步對(duì)梯度洗脫程序進(jìn)行優(yōu)化，使目標(biāo)物有較好的分離度，縮短樣品分析時(shí)間，提高了分析效率。最終確立了使用ZORBAX Eclipse Plus-C（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）色譜柱，采用梯度洗脫，樣品單次分析時(shí)間為7 min，滿足批量樣品的快速檢測(cè)分析。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化結(jié)果

參考文獻(xiàn)[15-16]方法，配制100 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在正離子模式下進(jìn)行一級(jí)全掃描質(zhì)譜得到準(zhǔn)分子離子（[M+H]），通過(guò)調(diào)試選擇最佳錐孔電壓和毛細(xì)管電壓，然后將準(zhǔn)分子離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，得到子離子特征碎片，選擇特征碎片中離子中響應(yīng)值高、基線噪聲低的兩對(duì)離子對(duì)作為定性離子和定量離子，優(yōu)化子離子對(duì)碰撞能量，使其豐度最大；進(jìn)一步優(yōu)化霧化器壓力、干燥和鞘氣的溫度及壓力等質(zhì)譜參數(shù)，使其離子化效率最佳，得到最優(yōu)的質(zhì)譜條件，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 8種抗真菌藥物檢測(cè)質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters for eight antifungal drugs

2.4 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.4.1 基質(zhì)效應(yīng)（matrix effect，ME）的評(píng)價(jià)

ME是指試樣中基質(zhì)成分會(huì)抑制或增強(qiáng)目標(biāo)化合物的離子化，當(dāng)ME過(guò)大時(shí)會(huì)降低方法的選擇性和靈敏度，影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，因而在建立分析方法時(shí)需對(duì)ME進(jìn)行評(píng)價(jià)，并采取適當(dāng)措施消除或減弱其對(duì)結(jié)果準(zhǔn)確性的影響。采用1.3.1節(jié)基質(zhì)匹配和純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線，并采用計(jì)算公式：ME/%=[（基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率/純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線斜率）-1]×100。通常，當(dāng)|ME|≤10%時(shí)，ME可忽略不計(jì)；當(dāng)|ME|在10%～20%之間時(shí)，存在較弱的ME；當(dāng)|ME|＞20%時(shí)，存在強(qiáng)ME。表2表明，8種抗真菌藥物在3種畜肉基質(zhì)中均存在強(qiáng)基質(zhì)抑制效應(yīng)，為校正ME對(duì)結(jié)果的影響，在定量分析中使用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線。本實(shí)驗(yàn)的ME評(píng)價(jià)結(jié)果與張凱等結(jié)果具有一致性。

2.4.2 方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限實(shí)驗(yàn)結(jié)果

采用空白基質(zhì)樣液配制系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（0.05～10.00 μg/L），在選定的色譜和質(zhì)譜條件下測(cè)定，以峰面積（）對(duì)其質(zhì)量濃度（）繪制校準(zhǔn)曲線。如表2所示，8種抗真菌藥物在各自線性范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（）均大于0.998。通過(guò)向陰性樣品中添加目標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以3 倍信噪比（=3）計(jì)算檢出限，以=10計(jì)算定量限。最終確定方法的檢出限為0.1 μg/kg，定量限為0.3 μg/kg。

表2 8種抗真菌藥物的線性方程、相關(guān)系數(shù)（r）、檢出限、定量限及METable 2 Linear equations, correlation coefficients (r), limits of detection,limits of quantification and matrix effects for eight antifungal drugs

續(xù)表2

2.4.3 加標(biāo)回收及精密度考察結(jié)果

采用基質(zhì)加標(biāo)法對(duì)加標(biāo)回收和精密度進(jìn)行考察，在豬肉、牛肉和羊肉陰性樣品中分別添加低、中、高3個(gè)加標(biāo)水平，每個(gè)添加水平重復(fù)6 次，連續(xù)做3 d，按照1.3.2節(jié)樣品前處理方法處理后上機(jī)測(cè)定，分別計(jì)算加標(biāo)回收率、準(zhǔn)確度和精密度（用變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）表示）。由表3可知，8種抗真菌藥物的準(zhǔn)確度均在15%以內(nèi)，日內(nèi)平均回收率為85.7%～113.6%，日內(nèi)CV為1.2%～14.8%；日間平均回收率為87.6%～107.9%，日間CV為2.1%～14.6%。本方法具有良好的回收率和精密度。標(biāo)準(zhǔn)溶液、空白樣品及加標(biāo)樣品MRM色譜圖見(jiàn)圖3。

表3 8種抗真菌藥物的平均回收率和精密度Table 3 Average recoveries and precision for eight antifungal drugs in meat

續(xù)表3

圖3 標(biāo)準(zhǔn)溶液、樣品空白及樣品加標(biāo)MRM色譜圖Fig. 3 MRM chromatograms of standard solution, blank samples and samples spiked with eight antifungal drugs

2.5 樣品檢測(cè)結(jié)果

按本研究建立的方法對(duì)市售的豬肉40 批次、牛肉30 批次、羊肉10 批次進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，豬肉中有1 批次檢出益康唑含量為3.96 μg/kg；牛肉中有1 批次檢出酮康唑含量為0.37 μg/kg，1 批次檢出灰黃霉素含量為0.75 μg/kg，3 批次檢出益康唑含量分別為0.47、0.33、0.34 μg/kg；其余樣品及指標(biāo)均未超檢出限。本方法可用于畜肉中8種抗真菌藥物殘留的檢測(cè)。

3 結(jié) 論

建立QuEChERS結(jié)合UPLC-MS/MS法快速測(cè)定畜肉中8種抗真菌藥物殘留量檢測(cè)方法。樣品用0.1%甲酸-乙腈提取，經(jīng)QuEChERS吸附劑凈化去除干擾物質(zhì)，簡(jiǎn)化前處理步驟，并有效提高了凈化效率。應(yīng)用本方法可在7 min內(nèi)完成畜肉中8種抗真菌藥物殘留分析，且目標(biāo)物有較好的分離度，相關(guān)系數(shù)（）均大于0.998，檢出限為0.1 μg/kg，定量限為0.3 μg/kg，8種抗真菌藥物在3種畜肉基質(zhì)中的準(zhǔn)確度在15%以內(nèi)，日內(nèi)平均回收率為85.7%～113.6%，日內(nèi)CV為1.2%～14.8%；日間平均回收率為87.6%～107.9%，日間CV為2.1%～14.6%。該方法檢出限和定量限低，加標(biāo)回收率和精密度良好，且前處理簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高、重復(fù)性好和分析準(zhǔn)確，能夠準(zhǔn)確定性和定量分析畜肉中8種抗真菌藥物殘留量，為日常分析檢測(cè)提供了技術(shù)支持。