摘 要：糖尿病心肌病作為糖尿病患者死亡的主要并發(fā)癥之一，目前在其治療上主要分為藥物治療、基因處理和運(yùn)動(dòng)干預(yù)三種方式，其中運(yùn)動(dòng)干預(yù)成本低無(wú)副作用，應(yīng)用較為廣泛。腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）的激活主要依賴于運(yùn)動(dòng)，大量研究證實(shí)了通過(guò)激活腺苷酸活化蛋白激酶來(lái)改善糖尿病心臟功能受損是具有實(shí)際意義的，通過(guò)研究運(yùn)動(dòng)干預(yù)對(duì)心肌糖脂代謝和線粒體功能的影響，以此探討腺苷酸活化蛋白激酶及其下游通路在糖尿病心肌病運(yùn)動(dòng)方面的作用，可為糖尿病心肌病的預(yù)防和治療提供重要參考。

關(guān)鍵詞：AMPKα2；糖尿病心肌??；運(yùn)動(dòng)干預(yù)

一、研究對(duì)象與研究方法

（一）研究對(duì)象與分組

8周齡轉(zhuǎn)基因小鼠及AMPKα2 KO小鼠各28只，分為WT組（基因正常對(duì)照組）和KO組（基因敲除組），再次將其隨機(jī)細(xì)分為WT+DS（高脂飲食基因正常組）、WT+DE 組（基因正常運(yùn)動(dòng)干預(yù)組）和KO+DS（高脂飲食基因敲除組）、KO+DE（運(yùn)動(dòng)干預(yù)基因敲除組）。各組小鼠分籠飼養(yǎng)，每組分為7籠，每籠4只，小組無(wú)干涉進(jìn)食、飲水，溫度恒溫20度，濕度百分之50，保持照明及通風(fēng)。

（二）運(yùn)動(dòng)方案

本項(xiàng)目的運(yùn)動(dòng)方案采取有氧抗組運(yùn)動(dòng)，在實(shí)驗(yàn)建模開(kāi)始前對(duì)所有小鼠進(jìn)行為期3day的運(yùn)動(dòng)性適應(yīng)周期，采取每周三天中間間隔一天的有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)，每次分為20分鐘和60分鐘；采取每周三天中間間隔一天的抗阻運(yùn)動(dòng)干預(yù)，采取垂直爬梯運(yùn)動(dòng)，無(wú)負(fù)重，頻率為每組4次，合計(jì)4組共16次。

（三）研究方法

1.隨機(jī)血糖測(cè)試

試驗(yàn)周期過(guò)半時(shí)對(duì)小鼠進(jìn)行隨機(jī)血糖測(cè)試。通過(guò)尾尖取血，利用血糖測(cè)試儀器及試紙測(cè)定小鼠隨機(jī)血糖值，剔除不符合要求的小鼠。

2.葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)

試驗(yàn)周期最后一周對(duì)小鼠進(jìn)行葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)。首先對(duì)小鼠進(jìn)行禁食12小時(shí)，對(duì)其腹腔注射葡萄糖溶液，注射后規(guī)定時(shí)間周期內(nèi)分別進(jìn)行尾尖取血。通過(guò)血糖測(cè)試儀器測(cè)定小鼠血糖值，繪制變化曲線。

3.心臟彩超檢查

對(duì)小鼠進(jìn)行麻醉后對(duì)其胸前區(qū)脫毛，使其仰臥并用設(shè)置好的頻率對(duì)其進(jìn)行彩超檢查。測(cè)定左房室瓣血流頻譜并進(jìn)行心尖切面，采集其動(dòng)態(tài)圖像，獲取LVEDd及LVESd，據(jù)此測(cè)算其EF，通過(guò)二尖瓣舒張?jiān)缙诜逯笛魉俣群褪鎻埻砥诜逯笛魉俣却_定比值。

4.血脂四項(xiàng)檢測(cè)

首先準(zhǔn)備試劑預(yù)備儀器，其次進(jìn)行血清制備。在試驗(yàn)周期結(jié)束后，對(duì)大鼠進(jìn)行稱重并注射濃度為百分之十的水合三氯乙醛麻醉劑進(jìn)行麻醉，麻醉后將小鼠仰臥解剖臺(tái)，腹部脫毛處理。用乙醇對(duì)其消毒后從腹部中線剪開(kāi)進(jìn)行動(dòng)脈取血。取得的血樣存入PE容器，冷藏30分鐘后進(jìn)行離心處理，離心后取上層血清置于冰箱冷藏以備測(cè)試。通過(guò)對(duì)甘油三脂和總膽固醇進(jìn)行測(cè)定，該項(xiàng)測(cè)定可采用專用試紙測(cè)定；進(jìn)行低密度脂蛋白和高密度脂蛋白進(jìn)行測(cè)定，可采用專用試紙測(cè)定。

5.取材

配置濃度為10%的水合三氯乙醛，準(zhǔn)備取材使用的相關(guān)器材，對(duì)小鼠進(jìn)行心臟彩超檢查后對(duì)其進(jìn)行乙醚麻醉后心臟取血后取材。首先采用手術(shù)剪和手術(shù)捏取出小鼠心臟，將其放置于提前生理鹽水浸濕的紗布上，然后將心臟上的血液吸取干凈后取下三分之一左心室放置于濃度為4%的聚蟻醛進(jìn)行固定進(jìn)行WGA染色，放置于冰箱冷藏；將剩余的部分左心室低溫冷凍。用手術(shù)剪剪開(kāi)小鼠下肢并將其脛骨與周圍及肌肉剝離，去除脛骨后置于濃度為4%的聚蟻醛進(jìn)行固定并放置于冰箱冷藏，對(duì)小鼠的脛骨長(zhǎng)度進(jìn)行測(cè)量，將其數(shù)值帶入計(jì)算小鼠心臟重量與脛骨的比值。

6.天狼腥紅染色和WGA染色

首先準(zhǔn)備相關(guān)試劑和儀器。其次是制備石蠟切片。石蠟切片的制備分為制備石蠟標(biāo)本（固定、組織處理、水洗、脫水、透明和包埋七個(gè)步驟）、制片（切片、展片、烤片等三個(gè)步驟）、天狼猩紅染色和麥胚凝集素染色。

7.蛋白質(zhì)印跡法

蛋白質(zhì)印跡法需要制備凝膠，將凝膠梳齒去掉，在預(yù)定孔中加入預(yù)染蛋白，依次將在將樣本分別加入凝膠孔中進(jìn)行電泳。采用濕式轉(zhuǎn)膜法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜后用Tris-HCl緩沖鹽溶液洗膜，將聚偏氟乙烯膜置于濃度為5%的脫脂牛奶中室溫放置2小時(shí)。然后再次用Tris-HCl緩沖鹽溶液洗膜，根據(jù)不同蛋白進(jìn)行一抗孵育。經(jīng)過(guò)Tris-HCl緩沖鹽溶液洗膜后室溫放置30分鐘進(jìn)行二抗孵育。將 Super ECL 底物發(fā)光液的A 液和 B? 液按 1：1 比例混合均勻，滴加至膜上進(jìn)行顯色。采用java的圖像處理軟件進(jìn)行目的蛋白分析。

8.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用 SPSS對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，統(tǒng)計(jì)方法使用方差分析，顯著性水平設(shè)為 0.05。數(shù)據(jù)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（M±SEM）表示。

二、AMPKα2在運(yùn)動(dòng)干預(yù)影響糖尿病心肌病中的作用

（一）AMPKα2基因敲除對(duì)運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)糖尿病心肌病小鼠體重和血液指標(biāo)的影響

現(xiàn)有研究已經(jīng)證明了運(yùn)動(dòng)在對(duì)于抑制肥胖，改善高血糖和高血脂等方面的重要作用。本項(xiàng)目研究通過(guò)對(duì)大鼠進(jìn)行運(yùn)動(dòng)干預(yù)后發(fā)現(xiàn)基因正常組的小鼠體重相對(duì)于基因敲除組的小鼠下降要更快，在實(shí)驗(yàn)后期階段基因正常運(yùn)動(dòng)干預(yù)組以及運(yùn)動(dòng)干預(yù)基因敲除組的體重開(kāi)始趨于穩(wěn)定，由此可見(jiàn)AMPKα2在小鼠運(yùn)動(dòng)中對(duì)減輕體重有重要的作用。雖然說(shuō)運(yùn)動(dòng)干預(yù)基因敲除組小鼠與基因正常運(yùn)動(dòng)干預(yù)組小鼠在糖耐量方面差異較小，但是運(yùn)動(dòng)干預(yù)基因敲除組小鼠的總膽固醇、甘油三酯以及低密度脂蛋白膽固醇是明顯要高于基因正常運(yùn)動(dòng)干預(yù)組的，血清高密度脂蛋白運(yùn)輸?shù)礁闻K的膽固醇要低于基因正常運(yùn)動(dòng)干預(yù)組。由此可以推測(cè)出運(yùn)動(dòng)對(duì)改善糖尿病心肌病高血脂有一定的作用，結(jié)合以往的學(xué)者研究可以看出AMPKα2運(yùn)動(dòng)在調(diào)節(jié)心肌糖脂代謝中起重要作用。

（二）AMPKα2基因敲除對(duì)運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)糖尿病心肌病小鼠結(jié)構(gòu)和功能的影響

現(xiàn)有研究證明，長(zhǎng)期堅(jiān)持運(yùn)動(dòng)，特別是適量的運(yùn)動(dòng)可以引起運(yùn)動(dòng)性心肌肥厚，可以人體的心臟起到一定的保護(hù)作用，同時(shí)也可以改善心肌方面的一些問(wèn)題。通過(guò)本項(xiàng)目研究結(jié)果可以看出，在經(jīng)過(guò)階段性的運(yùn)動(dòng)干預(yù)后，雖然說(shuō)各組糖尿病心肌病小鼠在心臟重量、心肌細(xì)胞大小和心肌纖維化程度上變化不大，但是通過(guò)對(duì)其細(xì)胞形態(tài)以及血管周圍纖維化面積發(fā)現(xiàn)有一定的下降趨勢(shì)；除此之外運(yùn)動(dòng)后的基因正常小鼠以及基因敲除小鼠的心肌舒張和收縮功能得到一定程度的強(qiáng)化，可見(jiàn)運(yùn)動(dòng)干預(yù)可以在一定程度上對(duì)糖尿病心肌病有一定的改善作用。本項(xiàng)研究還發(fā)現(xiàn)了，雖然說(shuō)運(yùn)動(dòng)干預(yù)基因敲除組小鼠的心肌收縮功能各指標(biāo)與基因正常運(yùn)動(dòng)干預(yù)組基本相似，但是其二尖瓣舒張?jiān)缙贓峰與二尖瓣舒張晚期A峰比值要明顯低于基因正常運(yùn)動(dòng)干預(yù)組，由此可見(jiàn)AMPKα2基因敲除對(duì)運(yùn)動(dòng)改善糖尿病心肌病有一定的抑制作用。

（三）AMPKα2基因敲除對(duì)運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)糖尿病心肌病小鼠心肌腺苷酸活化蛋白激酶和乙酰輔酶A的影響

運(yùn)動(dòng)對(duì)心肌、骨骼肌、肝臟和脂肪等外周組織的腺苷酸活化蛋白激酶以及乙酰輔酶A的磷酸化有一定的改善作用，同時(shí)對(duì)于糖脂代謝紊亂也有一定的改善作用，這點(diǎn)在本項(xiàng)研究中再次予以證實(shí)。通過(guò)本項(xiàng)研究的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，在對(duì)小鼠進(jìn)行運(yùn)動(dòng)干預(yù)后，各組小鼠的蛋白表達(dá)均得到一定程度的上升，可以看出運(yùn)動(dòng)是對(duì)糖尿病心肌病小鼠心肌腺苷酸活化蛋白激酶活性有一定的促進(jìn)作用的，同時(shí)可以抑制乙酰輔酶A的增加來(lái)達(dá)到改善心肌脂質(zhì)代謝紊亂的效果。除此之外，通過(guò)本項(xiàng)研究可以看出，AMPKα2基因敲除后，磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶α與心肌腺苷酸活化蛋白激酶的比值呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，由此可以推斷出運(yùn)動(dòng)對(duì)激活腺苷酸活化蛋白激酶α1有促進(jìn)作用，這也是高脂飲食基因敲除組磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶α要高于高脂飲食基因敲除組的重要因素。AMPKα2 基因敲除后，高脂飲食基因敲除組和運(yùn)動(dòng)干預(yù)基因敲除組的心肌磷酸化乙酰輔酶A表達(dá)減少，說(shuō)明運(yùn)動(dòng)具備抑制乙酰輔酶A活性的作用，可有效改善心肌脂質(zhì)代謝紊亂。

（四）AMPKα2基因敲除對(duì)運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)糖尿病心肌病小鼠心肌代謝的影響

首先是對(duì)改善糖代謝紊亂的影響方面。通過(guò)本項(xiàng)目研究結(jié)果可以看到，在運(yùn)動(dòng)干預(yù)后，基因正常小鼠和基因敲除小鼠的心肌的轉(zhuǎn)運(yùn)載體-4表達(dá)均有所提升，由此可見(jiàn)運(yùn)動(dòng)對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠心肌的轉(zhuǎn)運(yùn)載體-4有一定的改善作用。運(yùn)動(dòng)對(duì)160千道爾頓大小的底物蛋白的磷酸化水平也不依賴于AMPKα2，可見(jiàn)AMPKα2并非是運(yùn)動(dòng)對(duì)160千道爾頓大小的底物蛋白以及轉(zhuǎn)運(yùn)載體-4對(duì)葡萄糖的促進(jìn)作用所必需的。在運(yùn)動(dòng)干預(yù)后基因正常小鼠的磷酸化糖原合成酶激酶-3增加明顯，可以看出持之以恒的運(yùn)動(dòng)對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的糖尿病心肌病小鼠心肌磷酸化糖原合成酶激酶-3的活性增加，進(jìn)一步改善心肌糖原合成紊亂。在沒(méi)有運(yùn)動(dòng)干預(yù)時(shí)，雖然AMPKα2基因敲除對(duì)小鼠的磷酸化糖原合成酶激酶-3的表達(dá)并沒(méi)有產(chǎn)生直接影響，但是在運(yùn)動(dòng)干預(yù)后，AMPKα2基因敲除會(huì)導(dǎo)致糖尿病心肌病小鼠心肌磷酸化糖原合成酶激酶-3變化較小。由此可以得出結(jié)論，運(yùn)動(dòng)是通過(guò)AMPKα2來(lái)調(diào)節(jié)糖尿病心肌病小鼠心肌磷酸化糖原合成酶激酶-3的表達(dá)，來(lái)達(dá)到改善心肌糖原合成的目的。

其次是對(duì)改善小鼠心肌脂質(zhì)代謝的影響。現(xiàn)有研究已經(jīng)證實(shí)了運(yùn)動(dòng)在脂質(zhì)代謝，減緩肥胖或糖尿病機(jī)體能量代謝紊亂等方面發(fā)揮著重要的作用。本項(xiàng)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)糖尿病心肌病心肌脂肪酸轉(zhuǎn)位酶的表達(dá)依賴于AMPKα2，但是運(yùn)動(dòng)在中鏈酰基輔酶A脫氫酶以及肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1的表達(dá)上可能并非只有唯一途徑，具體還存在那些途徑，需要后期做進(jìn)一步的研究。

第三是對(duì)改善小鼠線粒體功能障礙的影響。研究證實(shí)了運(yùn)動(dòng)干預(yù)后基因正常小鼠和基因敲除小鼠的NAD-依賴性去乙?；窼irtuin-1增長(zhǎng)較快，可以推斷出持之以恒的運(yùn)動(dòng)對(duì)改善高脂飲食誘導(dǎo)的糖尿病心肌病小鼠心肌NAD-依賴性去乙?；窼irtuin-1活性降低的問(wèn)題，進(jìn)而對(duì)心肌線粒體功能障礙得到一定的改善。本研究同時(shí)證明了過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體以及雌激素相關(guān)受體α可以通過(guò)線粒體融合蛋白Mfn2來(lái)對(duì)線粒體的功能進(jìn)行調(diào)節(jié)。在一個(gè)階段的運(yùn)動(dòng)干預(yù)后，基因正常小鼠和基因敲除小鼠的過(guò)氧化物酶體增殖劑激活受體α在一定程度上表現(xiàn)出降低趨勢(shì)。由此可見(jiàn)，持之以恒的運(yùn)動(dòng)干預(yù)對(duì)于高脂飲食誘導(dǎo)的糖尿病心肌病小鼠心肌過(guò)氧化物酶體增殖劑激活受體α增加，可改善心肌脂質(zhì)代謝紊亂。

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作者簡(jiǎn)介：鄭勇（1982—），男，碩士，河南周口人，現(xiàn)為鄭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院副教授，研究方向體育教育學(xué)。

項(xiàng)目來(lái)源：河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目，項(xiàng)目編號(hào)20A890017，名稱：AMPKα2基因在糖尿病心肌病運(yùn)動(dòng)干預(yù)研究。