王瀟然，于美琴，韋一昊，張志勇，李會強，王小純,*

過表達對煙草氮素吸收的影響

王瀟然1，于美琴1，韋一昊2，張志勇2，李會強1，王小純1,2*

1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450002；2 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，河南糧食作物協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450002

【】為揭示小麥氮素同化關(guān)鍵酶谷氨酰胺合成酶（TaGS1/TaGS2）在煙草中過表達對煙草氮素吸收同化能力的影響及其機制?！尽恳詿煵菰耘嗥贩NK326為對照，測定分析過表達/煙草的生長及氮代謝指標(biāo)；利用轉(zhuǎn)錄組結(jié)合進化樹分析，確定煙草硝酸轉(zhuǎn)運蛋白家族（NtNRT/NPF）及其表達水平。【】過表達/煙草根系發(fā)達、葉片變大，氮素吸收同化積累顯著升高；在煙草中鑒定到36個/家族基因；過表達/引起其中28個/家族基因表達變化，與qRT-PCR結(jié)果一致?！尽窟^表達/可能通過提高、、等/家族基因表達，促進煙草氮素吸收、同化與積累，為煙草生長發(fā)育提供充足氮源。

GS；氮吸收；硝酸轉(zhuǎn)運蛋白；過表達；煙草

氮是影響植物生長發(fā)育的重要營養(yǎng)元素，是構(gòu)成蛋白質(zhì)、核酸、葉綠素、輔酶、維生素以及煙堿、煙氣致香物質(zhì)的組成成分，對煙葉的產(chǎn)量和品質(zhì)起著關(guān)鍵作用[1-4]。探索提升煙草氮素吸收和利用效率的途徑，挖掘其分子機制，不僅對提高煙草產(chǎn)量及品質(zhì)，降低生產(chǎn)成本具有重要價值，同時對緩解氮肥過度使用造成的農(nóng)業(yè)面源污染具有積極意義。

在高等植物中，氮素的同化是通過谷氨酰胺合成酶/谷氨酸合成酶循環(huán)（GS/GOGAT）完成的，其中谷氨酰胺合成酶（Glutamine Synthetase，GS）作為無機氮轉(zhuǎn)化為有機氮關(guān)鍵節(jié)點的催化酶，在氮素利用過程中至關(guān)重要[1]。高等植物中按照其亞細胞定位的不同可將GS分為2類：胞質(zhì)型GS（GS1）和質(zhì)體型GS（GS2）[5]。GS1主要參與植物根系NH4+的初始同化和衰老葉中氮的再轉(zhuǎn)移[6-7]。而GS2主要在葉綠體表達，負責(zé)植物光呼吸釋放的NH4+及NO3-還原產(chǎn)生的NH4+的同化過程[8]。Oliveira等研究證實，煙草過表達大豆基因可以顯著提高其干重和鮮重[9]。煙草過表達基因可促進煙草氨基酸積累，加速幼苗生長，使植株鮮重提高20%～30%[10]。由此可知，過表達基因可提高煙草對氮的利用效率，然而，過表達基因是否通過調(diào)節(jié)/家族基因表達實現(xiàn)對氮素利用效率的提高尚不清楚。

植物根系主要以硝態(tài)氮（NO3-）和銨態(tài)氮（NH4+）兩種形式從土壤中攝取氮素，煙草以吸收土壤中硝態(tài)氮為主[11]。負責(zé)植物硝酸鹽吸收和轉(zhuǎn)運的是硝酸轉(zhuǎn)運蛋白（Nitrate Transporter/Peptide Transporter Family，NRT/NPF），根據(jù)它們轉(zhuǎn)運硝酸鹽的活性，可分為高親和性（NRT2）和低親和性（NRT1）兩類[12]。NRT2是高親和力硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白家族，其中NRT2.1、NRT2.2、NRT2.4、NRT2.5在根系表達，在硝酸鹽的吸收過程中發(fā)揮重要作用[12-17]。NRT1（NPF）主要由低親和力硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白構(gòu)成，其中NRT1.1（NPF6.3）、NRT1.2（NPF4.6）是植物根系對NO3-吸收的核心成員[18-20]。除了NRT2和NPF外，還有另一個成員NRT3，它與NRT2相互作用參與高親和硝酸鹽的運輸[21-22]。目前在擬南芥和水稻中，/家族基因得到了較為深入的研究，然而煙草/家族基因成員數(shù)量及其功能的研究仍鮮有報道。

本研究以煙草栽培品種K326為對照，研究了過表達/基因?qū)煵萆L發(fā)育、氮代謝、/家族基因表達水平的影響，揭示過表達/基因?qū)煵莸盏挠绊懠捌錂C制，為氮高效煙草種質(zhì)資源創(chuàng)制提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗材料包括煙草栽培品種K326（L.）及其過表達（DQ124209）純合株系OE-TaGS1-1、OE-TaGS1-2和OE-TaGS1-3，過表達（DQ124212）純合株系OE-TaGS2-1、OE-TaGS2-2和OE-TaGS2-3，由本實驗室保存[23]。

1.2 煙草幼苗的培養(yǎng)

過表達/煙草株系及K326種子分別用75%酒精處理4 min，6.25%次氯酸鈉處理10min，無菌水沖洗后轉(zhuǎn)入MS滅菌培養(yǎng)基中于25℃，光周期16/8 h條件下培養(yǎng)10 d。移栽到直徑7 cm、高10 cm的盆缽中（蛭石與營養(yǎng)土以3:2混勻），培養(yǎng)19 d后選取生長一致的煙苗移栽到育苗盆中，每盆1株，繼續(xù)培養(yǎng)。

苗齡45 d時（10葉期），拍照記錄OE-TaGS1、OE-TaGS2及K326煙草植株地上部及根系形態(tài)，并統(tǒng)計干重（3次生物學(xué)重復(fù)）。同時，隨機選取同批移栽O(shè)E-TaGS1、OE-TaGS2及K326各3個單株分別取根系、從下往上數(shù)第6、7、8片展開葉，液氮速凍后于-80℃保存。

1.3 氮含量測定

將煙草組織在液氮中研磨至粉末狀，采用Berthelot顏色反應(yīng)法測定NH4+含量[24]，采用水楊酸比色法測定NO3-含量[25]。煙草組織烘干粉碎后采用流動分析儀測定總氮（Total nitrogen, TN）含量[26]。葉片（根系）氮積累量，單位干重葉片（根系）氮素含量×單株葉片（根系）總干重。

1.4 煙草根系轉(zhuǎn)錄組測序

取OE-TaGS1、OE-TaGS2及K326煙草的根系，每個株系2次技術(shù)重復(fù)，液氮研磨后各取3 g送北京百邁克有限公司進行轉(zhuǎn)錄組測序，剩余樣品-80℃保存。RNA-Seq數(shù)據(jù)用R語言DESeq數(shù)據(jù)包進行差異基因篩選，篩選條件為變異倍數(shù)（上調(diào)/下調(diào)）大于等于1.5倍，且FDR≤0.001,差異基因相對表達量以log2（FPKMOE/FPKMWT）表示。

1.5 RNA提取和cDNA合成

取煙草根系樣品，采用RNE35廣譜型植物RNA提取試劑盒（諾貝萊）提取RNA，cDNA合成按照HiScriptⅡQ RT SurMix for qRT-PCR（+gDNA wir）說明書進行反轉(zhuǎn)錄。

1.6 熒光定量PCR

基于根系RNA-Seq測序結(jié)果，篩選表達豐度較高的/家族基因設(shè)計引物，引物由上海生工合成（表1）。以煙草（LOC107800553）為內(nèi)參基因，設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)，反應(yīng)程序參照諾唯贊公司的AceQ qRT-PCR SYBR Green Master Mix說明書，利用Bio-Rads實時熒光定量PCR儀進行定量檢測。數(shù)據(jù)利用2-ΔΔCt方法計算。（轉(zhuǎn)基因植株的目標(biāo)基因表達量為ΔCtOE=2-（Ct目標(biāo)基因-Ct內(nèi)參基因），野生型植株目標(biāo)基因表達量為ΔCtWT=2-（Ct目標(biāo)基因-Ct內(nèi)參基因），轉(zhuǎn)基因與野生型植株的差異倍數(shù)為F=ΔCtOE/ΔCtWT，即2-ΔΔCt）

表1 qRT-PCR引物序列

續(xù)表1

基因名稱(Gene name)上游引物序列（5'-3'）(Upstream primer sequence)下游引物序列（5'-3'）(Downstream primer sequence) NPF5.6AATCTCAGTTGGGACAGGAGGGCACCAAGTAATAGTCCGCAGCATA NPF6.3ATTTTAGGAGTTGAGGCAGTGGAGGTAACAATGTTTGCGGCGTTAG NPF6.4AGCAGGCTCCTTTTCCGTCAGTATCAGTCCGATTCCAACCG NPF7.3GGGTTGTCCATGTCTTCCTCAGATCCAAGTGCCCGTCGTTTA β-actinTACTTACTGAAGCACCCTTGAATCCGATCACGACCAGCAAGATCCAAC

1.7 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

基于組學(xué)數(shù)據(jù)獲取K326煙草相關(guān)硝酸轉(zhuǎn)運蛋白的氨基酸序列，根據(jù)Ensembl Plants（http://plants. ensembl.org/index.html）獲取擬南芥及水稻相關(guān)硝酸轉(zhuǎn)運蛋白的氨基酸序列，采用MEGA 7.0軟件構(gòu)建進化樹，方法為鄰接法（Neighbor-Joining），Bootstrap次數(shù)為1000。

1.8 數(shù)據(jù)處理

利用Microsoft Excel和Graphpad Prism 8進行數(shù)據(jù)處理，采用SPSS 20.0進行方差分析（S-N-K），<0.05。

2 結(jié)果

2.1 過表達TaGS1/TaGS2對煙草苗期生長的影響

煙苗生長至10葉期時，OE-TaGS1和OE-TaGS2與栽培品種K326相比葉面積增大（圖1A），根系更加發(fā)達，主根顯著長于野生型（圖1B）。OE-TaGS1和OE-TaGS2的地上部與根系干重均呈現(xiàn)顯著高于K326（圖1C）?？梢?，過表達/基因能夠促進煙苗生長，提高生物量。

注：（A）不同株系的表型；（B）根長；（C）干物重。不同小寫字母表示不同植株間差異顯著（P＜0.05），下同。

2.2 過表達TaGS1/TaGS2對煙草氮素含量的影響

對K326、OE-TaGS1和OE-TaGS2的葉片和根部氮素含量及積累量的測定結(jié)果表明，每克植株干重平均氮含量表現(xiàn)為TN（35 mg）>NO3-（6 μg）>NH4+（0.2 μg），葉片NH4+含量與根系NH4+含量一致，僅約0.2 μg；葉片NO3-含量約50 μg，是根系的5倍?？梢姡~片及根系總氮主要以蛋白質(zhì)等有機氮形式存在，有機氮主要來源于根系對無機氮（主要是NO3-）吸收轉(zhuǎn)運及葉片的同化，因此植株總氮可以代表煙草對無機氮的吸收轉(zhuǎn)運及同化積累。OE-TaGS1和OE-TaGS2葉片總氮含量與K326沒有顯著差異（圖2A），但氮素積累量顯著高于K326（圖2C）；OE-TaGS1和OE-TaGS2根系總氮含量及積累量顯著高于K326（圖2B、圖2D）?？梢?，過表達/可促進煙草氮素的吸收同化。OE-TaGS2和K326葉片NO3-含量及總量差異不大，但均顯著高于OE-TaGS1；OE-TaGS1和OE-TaGS2根系NO3-含量及總量顯著高于K326，過表達/可促進根系對NO3-吸收。葉片NH4+含量表現(xiàn)為OE-TaGS2>K326>OE-TaGS1，但總量差異不大；根系NH4+含量表現(xiàn)為K326>OE-TaGS2> OE-TaGS1，根系NH4+總量K326>OE-TaGS2>OE- TaGS1（圖2B、圖2D），推測過表達促進根系中NH4+同化，故而含量降低。由此可見，過表達/可促進根系對NO3-的吸收、植株對氮素的同化利用。

注：（A）葉片含氮量；（B）根系氮含量；（C）葉片氮積累量；（D）根系氮積累量。

2.3 煙草硝酸轉(zhuǎn)運蛋白家族進化分析

植物NO3-的吸收與運輸主要由NRT/NPF家族蛋白完成。在K326、OE-TaGS1和OE-TaGS2煙草根系轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中鑒定到36個NtNRT/NPF家族蛋白，其中30個NtNPF，4個NtNRT2，2個NtNRT3。將上述36個蛋白與擬南芥及水稻同源蛋白（擬南芥55個，水稻22個）進行進化樹分析，顯示煙草NtNRT/NPF家族蛋白分為3類，即NtNPF、NtNRT2及NtNRT3，且煙草NtNRT/NPF與相應(yīng)的擬南芥蛋白同源性更高（圖3）。

注：紅色標(biāo)記為煙草的36個硝酸轉(zhuǎn)運蛋白。

2.4 過表達TaGS1/TaGS2對煙草根系NRT/NPF家族基因表達的影響

根系轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析顯示，與K326相比，OE-TaGS1和OE-TaGS2根系有28個/家族基因差異表達，其中在二者中同時上調(diào)表達有5個，根據(jù)表達豐度高低依次為、、、和；僅在OE-TaGS1上調(diào)表達有7個，依次為、、、、和；僅在OE-TaGS2上調(diào)表達的有4個，依次為、、和；其余12個基因在轉(zhuǎn)/煙草中有不同程度下調(diào)或無差異表達（圖4A）。利用qRT-PCR對10個差異表達硝酸轉(zhuǎn)運蛋白基因進行檢測，并利用上述基因生成回歸曲線證實轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可靠（R>0.6，圖4D、E）。同時發(fā)現(xiàn)在OE-TaGS1轉(zhuǎn)錄組下調(diào)表達，而qRT-PCR檢測其顯著上調(diào)（圖4B、C）?？梢姡^表達和可能通過調(diào)節(jié)不同硝酸轉(zhuǎn)運蛋白的表達影響煙草對氮素吸收效率。

注：（A）基于轉(zhuǎn)錄組的差異基因分析；（B、C）OE-TaGS1和OE-TaGS2轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)驗證；（D、E）回歸曲線。

3 討論

氮素的吸收、運輸和利用是影響植物生長發(fā)育的最重要因素之一。GS是氮素同化的關(guān)鍵酶，小麥過表達促進地上部和根系發(fā)育，顯著提高生物量[27]。煙草過表達能夠促進NO3-吸收及NH4+同化，顯著提高煙草干鮮重[28]。本研究表明，煙草過表達或植株生物量和氮素積累量顯著提高，即過表達可以提高煙草植株無機氮同化效率，與他人研究結(jié)論一致。氮同化及生物量的增加必然與氮吸收的增加密切相關(guān)，但過表達外源基因如何影響煙草氮吸收相關(guān)轉(zhuǎn)運蛋白的表達鮮有報道。

植物氮素主要以硝態(tài)氮（NO3-）和銨態(tài)氮（NH4+）兩種無機氮形式吸收，其中又以NO3-為主[29]。硝酸還原酶（NR）和亞硝酸還原酶（NiR）在氮素同化過程將NO3-還原為NH4+，為GS提供催化底物[30]。NR、NiR及GS等氮素同化相關(guān)酶在脅迫條件下呈現(xiàn)共表達趨勢[31]。因此，過表達促進NH4+同化也必然提升NO3-利用效率。本研究表明，OE-TaGS1根系及OE-TaGS2根系和葉片NO3-含量比K326出現(xiàn)不同程度增加，過表達/煙草總氮含量顯著提高，證明過表達促進煙草對NO3-的吸收和同化，為促進煙草生長奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

NRT/NPF家族蛋白是植物體內(nèi)NO3-主要轉(zhuǎn)運體，不同家族成員負責(zé)植物根部對NO3-吸收及組織內(nèi)部運輸[32]。轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，過表達/導(dǎo)致多個/家族基因發(fā)生表達變化，這可能是轉(zhuǎn)基因煙草中NO3-吸收效率改變的重要原因。NPF6.3（NRT1.1）是植物中第一個被鑒定出的家族基因成員，在NO3-的吸收及轉(zhuǎn)運過程中發(fā)揮重要作用，一旦其功能缺失可能誘發(fā)生長素（IAA）積累，進而導(dǎo)致植物側(cè)根發(fā)育受到抑制[33]。組學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)可能僅在OE-TaGS2中上調(diào)表達，可靠性更高的qRT-PCR驗證可知過表達均引發(fā)表達上調(diào)，說明對OE-TaGS1和OE-TaGS2中NO3-吸收和積累發(fā)揮重要作用。通過調(diào)控及基因表達，改變根系對NO3-的吸收效率[34]，本研究發(fā)現(xiàn)過表達均引發(fā)表達上調(diào)，且葉片氮積累量高于K326，說明可提高OE-TaGS1和OE-TaGS2根系對氮的吸收轉(zhuǎn)運效率。為低親和轉(zhuǎn)運體系，在木質(zhì)部表達，介導(dǎo)硝酸鹽經(jīng)由木質(zhì)部向地上運輸[35]，本研究發(fā)現(xiàn)過表達均引發(fā)顯著上調(diào)，促進煙草根部對硝態(tài)氮吸收，提高煙草對NO3-的轉(zhuǎn)運能力。

GS1主要存在于輸導(dǎo)組織細胞質(zhì)中，GS2主要存在于葉肉細胞的葉綠體中，二者在無機氮同化過程中存在功能差異[36]。這可能導(dǎo)致OE-TaGS1和OE-TaGS2煙草部分/家族基因呈現(xiàn)不同變化趨勢。盡管過表達/煙草表型及生理指標(biāo)相似，但家族基因表達存在差異，推測不同家族基因可能與相同激素作用調(diào)控氮吸而收[12]，也可能在煙草中存在相對保守的機制，導(dǎo)致/過表達均能提升煙草的氮素吸收和利用效率，但其分子機制仍待深入研究。

4 結(jié)論

過表達/基因均能夠促進煙草的生長，影響硝酸轉(zhuǎn)運蛋白家族36個成員中28個成員發(fā)生表達變化，可能調(diào)控、、等表達上調(diào)，進而促進硝態(tài)氮吸收，為GS同化無機氮提供原料。

[1] Bernard S M, Habash D Z. The importance of cytosolic glutamine synthetase in nitrogen assimilation and recycling[J]. New Phytologist, 2009, 182(3): 608-620.

[2] Bloom A J. The increasing importance of distinguishing among plant nitrogen sources[J]. Current Opinion in Plant Biology, 2015, 25: 10-16.

[3] Thomsen H C, Eriksson D, M?ller I S , et al. Cytosolic glutamine synthetase: a target for improvement of crop nitrogen use efficiency?[J]. Trends in Plant Science, 2014, 19(10): 656-663.

[4] 鄭昕，史宏志，楊興有，等. 施氮量與留葉數(shù)對萬源曬紅煙產(chǎn)質(zhì)量和香氣成分的影響[J]. 中國煙草科學(xué)，2018, 39(01): 49-56.

ZHENG Xin, SHI Hongzhi, YANG Xingyou, et al. Effects of nitrogen rates and numbers of leaves remained on yield, quality and aroma components of sun-cured red tobacco[J]. Chinese Tobacco Science, 2018, 39(01): 49-56.

[5] Martin A, Lee J, Kichey T, et al. Two cytosolic glutamine synthetase isoforms of maize are specifically involved in the control of grain production[J]. Plant Cell, 2006, 18(11): 3252-3274.

[6] Liliana A O, Michael M, Kohki Y, et al. Autophagy, plant senescence, and nutrient recycling[J]. Journal of Experimental Botany, 2014, 65(14): 3799-3811.

[7] Guan M, M?ller I S, Schjoerring J K. Two cytosolic glutamine synthetase isoforms play specific roles for seed germination and seed yield structure in Arabidopsis[J]. Journal of Experimental Botany, 2015, 66(1): 203-212.

[8] Wallsgrove R M, Turner J C, Hall N P, et al. Barley mutants lacking chloroplast glutamine synthetase-biochemical and genetic analysis[J]. Plant Physiology, 1987, 83(1): 155-158.

[9] Oliveira I C, Brears T, Knight T J, et al. Overexpression of cytosolic glutamine synthetase. Relation to nitrogen, light, and photorespiration[J]. Plant Physiology, 2002, 129(3): 1170-1180.

[10] Migge A, Carrayol E, Hirel B, et al. Leaf-specific overexpression of plastidic glutamine synthetase stimulates the growth of transgenic tobacco seedlings[J]. Planta, 2000, 210(2): 252-260.

[11] 馮新維，黃鶯，陳東，等. 烤煙氮代謝研究進展[J]. 分子植物育種，2021: 1-26.

FENG Xinwei, HUANG Ying, CHEN Dong, et al. An overview of nitrogen metabolism in flue-cured tobacco[J]. Molecular Plant Breeding, 2021: 1-26.

[12] Wang Y Y, Cheng Y H, Chen K E, et al. Nitrate transport, signaling, and use efficiency[J]. Annual Review of Plant Biology, 2018, 69: 85-122.

[13] Filleur S, Dorbe M F, Cerezo M, et al. AnT-DNA mutant affected ingenes is impaired in nitrate uptake[J]. Federation of European Biochemical Societies Letters, 2001, 489(2): 220-224.

[15] 黃化剛，申燕，王衛(wèi)峰，等. 煙草硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因的克隆及表達分析[J]. 中國煙草學(xué)報，2016, 22(01): 84-91.

HUANG Huagang, SHEN Yan, WANG Weifeng et al. Cloning and characterization ofgene fromL[J]. Acta Tabacaria Sinica, 2016, 22(01): 84-91.

[16] Corratgé-Faillie C, Lacombe B. Substrate (un)specificity ofNRT1/PTR FAMILY (NPF) proteins[J]. Journal of Experimental Botany, 2017, 68(12): 3107-3113.

[17] Krapp A, David L C, Chardin C, et al. Nitrate transport and signalling in[J]. Journal of Experimental Botany, 2014, 65(3): 789-798.

[18] Li H, Hu B, Chu C C. Nitrogen use efficiency in crops: lessons from Arabidopsis and rice[J]. Journal of Experimental Botany, 2017, 68(10): 2477-2488.

[19] Huang N C, Liu K H, Lo H J, et al. Cloning and functional characterization of annitrate transporter gene that encodes a constitutive component of low-affinity uptake[J]. The Plant Cell, 1999, 11(8): 1381-1392.

[20] Ho C H, Lin S H, Hu H C, et al.functions as a nitrate sensor in plants[J]. Cell, 2009, 138(6): 1184-1194.

[21] Plett D, Toubia J, Garnett T, et al. Dichotomy in thegene families of dicots and grass species[J]. PLoS One, 5(12): e15289.

[22] Kotur Z, Mackenzie N, Ramesh S, et al. Nitrate transport capacity of thethaliana NRT2 family members and their interactions with[J]. New Phytologist, 2012, 194(3): 724-731.

[23] 韋一昊. 過表達或?qū)煵萆L和氮代謝的影 響[D]. 鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016.

WEI Yihao. Constitutive overexpression of glutamine synthetase 1 gene or glutamine synthetase 2 gene affects growth and nitrogen metabolism in transgenic tobacco[D]. Henan Agricultural University, 2016.

[24] Gordon S A, Fleck A, Bell J. Optimal conditions for the estimation of ammonium by the berthelot reaction[J]. Annals of Clinical Biochemistry, 1978, 15(5): 270-275.

[25] 謝紅偉. 水楊酸比色法測定水中硝酸鹽氮的含量[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，1999, 27(03): 41-42.

XIE Hongwei. Determination of nitrogen content in nitrate by salicylic acid colorimetry in water[J]. Guizhou Agricultural Sciences, 1999, 27(03): 41-42.

[26] 王小純，王曉航，熊淑萍，等. 不同供氮水平下小麥品種的氮效率差異及其氮代謝特征[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2015, 48(13): 2569-2579.

WANG Xiaochun, WANG Xiaohang, XIONG Shuping, et al. Differences in nitrogen efficiency and nitrogen metabolism of wheat varieties under different nitrogen levels[J]. Scientia Agricultura Sinica, 2015, 48(13): 2569-2579.

[27] Hu M, Zhao X, Liu Q, et al. Transgenic expression of plastidic glutamine synthetase increases nitrogen uptake and yield in wheat[J]. Plant Biotechnology Journal, 2018, 16(11): 1858-1867.

[28] Zheng J S, Yu C M, Chen P, et al. Characterization of a glutamine synthetase genefrom ramie (L. Gaud) and biochemical assays of-2-over-expressing transgenic tobacco[J]. Acta Physiol Plant, 2015, 37(1): 1742.

[29] 張杰，黃海棠，楊立均，等. 氮素形態(tài)對煙草生長及品質(zhì)影響的研究進展[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報，2018, 34(15): 38-43.

ZHANG Jie, HUANG Haitang, YANG Lijun, et al. Nitrogen forms affecting tobacco growth and quality: research progress[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2018, 34(15): 38-43.

[30] Krapp A. Plant nitrogen assimilation and its regulation: a complex puzzle with missing pieces[J]. Current Opinion in Plant Biology, 2015, 25: 115-122.

[31] Seema S, Luis R A, Katarzyna G, et al.andexpression levels reveal NO and ABA mediated drought tolerance inL[J]. Scientific Reports, 2021, 11(1): 7992.

[32] Tegeder M, Masclaux-Daubresse C. Source and sink mechanisms of nitrogen transport and use[J]. The New Phytologist, 2018, 217(1): 35-53.

[33] Krouk G, Lacombe B, Bielach A, et al. Nitrate-regulated auxin transport by NRT1.1 defines a mechanism for nutrient sensing in plants[J]. Developmental Cell, 2010, 18(6): 927-937.

[34] Okamoto M, Kumar A, Li W, et al. High-affinity nitrate transport in roots of Arabidopsis depends on expression of the-like gene[J]. Plant Physiology, 2006, 140(3): 1036-1046.

[35] Lin H S, Kuo H F, Canivenc C, et al. Mutation of the Arabidopsisnitrate transporter causes defective root-to-shoot nitrate transport[J]. The Plant Cell, 2008, 20(9): 2514-2528.

[36] Bernard S M, M?ller A L B, Dionisio G, et al. Gene expression, cellular localisation and function of glutamine synthetase isozymes in wheat (L.)[J]. Plant Molecular Biology, 2008, 67(1-2): 89-105.

The effect of/overexpression on nitrogen uptake in tobacco

WANG Xiaoran1, YU Meiqin1, WEI Yihao2, ZHANG Zhiyong2, LI Huiqiang1, WANG Xiaochun1,2*

1 College of Life Sciences, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China;2 Collaborative Innovation Center of Henan Grain Crops, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China

This study aims to reveal the effects of wheat glutamine synthetase(/) overexpression on nitrogen uptake and assimilation in tobacco (L.) as well as the hidden mechanism.Taking the tobacco cultivar K326 as control, the growth and nitrogen metabolism indicators of overexpressed transgenic lines/(OE-TaGS1/OE-TaGS2) were detected; RNA-Seq and cluster analysis were used to identify nitrate transporter (NtNRT/NPF) family members and analyze the abundance of/genes.The overexpressed/showed stronger roots, larger leaf area, the significant increasing accumulation and assimilation of nitrogen. A total of 36 genes of/were identified from the RNA-Seq, 28 genes among them showed variation on RNA level, which was consistent with qRT-PCR results.The/overexpression may trigger up-regulation of the crucial members of/family in tobacco, such as,and, etc., which promotes nitrogen uptake, assimilation and accumulation and provides sufficient nitrogen for tobacco growth and development.

GS; nitrogen uptake; nitrate transporter; overexpression; tobacco

Corresponding author. Email：xiaochun.w@163.com

不同氮效率小麥品種氮素吸收、同化及轉(zhuǎn)運差異的分子機理（32071956）

王瀟然（1983—），博士，副教授，主要研究方向為植物氮代謝，Tel：0371-63555790，Email：xiaoranwang@henau.edu.cn

王小純（1966—），Tel：0371-63555790，Email：xiaochun.w@163.com

2021-11-08；

2022-02-22

王瀟然，于美琴，韋一昊，等. 過表達TaGS1/TaGS2對煙草氮素吸收的影響[J]. 中國煙草學(xué)報，2022，28（3）.WANG Xiaoran, YU Meiqin, WEI Yihao, et al. The effect of TaGS1/TaGS2 overexpression on nitrogen uptake in tobacco[J]. Acta Tabacaria Sinica, 2022, 28(3). doi:10.16472/j.chinatobacco. 2021.T0202