文│朱寬峰（北京田園奧瑞生物科技有限公司）

計(jì)算機(jī)輔助精液質(zhì)量分析系統(tǒng)（computer assisted semen analysis system，CASAS）是使用計(jì)算機(jī)技術(shù)進(jìn)行精液質(zhì)量分析的儀器，正確使用可以有效降低人工檢測(cè)的誤差大、主觀性強(qiáng)的缺點(diǎn)。但很多技術(shù)員甚至科研人員對(duì)CASAS不太了解，存在一些誤解，筆者根據(jù)對(duì)CASAS研發(fā)與使用的經(jīng)驗(yàn)對(duì)CASAS做一個(gè)介紹，期望能讓大家對(duì)此有更多的認(rèn)識(shí)。

一、CASAS的原理

1.CASAS系統(tǒng)組成。包括硬件和軟件兩部分，其中硬件主要包括顯微鏡、高清高速攝像頭、計(jì)算機(jī)等部分，軟件包括相機(jī)驅(qū)動(dòng)軟件、精液質(zhì)量分析軟件等。

2.原理。顯微鏡成的像被高清攝像頭采集，經(jīng)過計(jì)算機(jī)處理后識(shí)別出精子，并構(gòu)建精子軌跡，進(jìn)而計(jì)算出精子各項(xiàng)運(yùn)動(dòng)參數(shù)，并輸出各項(xiàng)監(jiān)測(cè)指標(biāo)。

（1）精子識(shí)別。精液樣品，更為通常雜質(zhì)比較少，最簡(jiǎn)單的識(shí)別方法就是將圖像中一定大小范圍的亮斑或者暗斑識(shí)別出來即可，更為精確的還需要計(jì)算斑塊的長(zhǎng)度寬度等信息。有一些智能算法則是基于訓(xùn)練模型，先通過人工訓(xùn)練，積累數(shù)據(jù)，優(yōu)化模型從而對(duì)實(shí)際樣本進(jìn)行檢測(cè)。

（2）構(gòu)建軌跡。相機(jī)獲取的是一系列有時(shí)間順序的靜態(tài)圖像，通過一定的算法將這些圖像中的精子進(jìn)行一一匹配，從而構(gòu)建出所有精子的運(yùn)動(dòng)軌跡。

（3）運(yùn)動(dòng)參數(shù)定義。最基礎(chǔ)的運(yùn)動(dòng)參數(shù)定義見表1，對(duì)應(yīng)的示意圖見下圖。根據(jù)這些參數(shù)的定義可以計(jì)算出各種運(yùn)動(dòng)參數(shù)，并為活力、活率等指標(biāo)的計(jì)算做基礎(chǔ)。

表1 精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)表

（4）主要指標(biāo)的定義。主要的指標(biāo)包括密度、活力、活率，以及其他一些輔助的指標(biāo)。

活力是指前向精子占總精子的百分比，活力＝視野中前向精子數(shù)/視野總精子數(shù)×100%。

活率是指活動(dòng)精子占總精子的百分比，活率＝視野中活動(dòng)精子數(shù)/視野總精子數(shù)×100%。

密度是指單位體積的精子數(shù)，密度＝視野精子數(shù)/視野體積＝視野精子數(shù)/（視野長(zhǎng)度×視野寬度×腔室厚度）。

一般檢測(cè)時(shí)多個(gè)視野的平均值或者匯總數(shù)據(jù)，因此還需要對(duì)上述數(shù)據(jù)求平均值。

二、引起檢測(cè)誤差的因素

1.成像質(zhì)量。所有的分析基礎(chǔ)都建立在成像的基礎(chǔ)上，成像不清晰的話會(huì)導(dǎo)致子識(shí)別困難。從樣品到軟件識(shí)別的圖像，需要經(jīng)過顯微鏡物鏡成像、攝像頭采集、圖像處理等多個(gè)步驟，每一個(gè)步驟有問題都會(huì)影響圖像質(zhì)量。

（1）顯微鏡。對(duì)于顯微鏡成像來說，光源的穩(wěn)定性和均勻性、鏡片有無上有無灰塵、鏡頭是否污染、蓋玻片厚度是否與鏡頭匹配都會(huì)影響成像質(zhì)量。不同類型的顯微鏡成像清晰度也不一樣，是否正確使用也是關(guān)鍵。對(duì)于普通生物顯微鏡來說，可變光闌是否調(diào)到合適位置其成像質(zhì)量也會(huì)有很大差異。對(duì)于相差顯微鏡來說，聚光鏡是否調(diào)到位、相差環(huán)是否對(duì)中、相差片與物鏡是否對(duì)應(yīng)都能影響顯微鏡的成像質(zhì)量。

（2）玻片。對(duì)于玻片來說，玻片潔凈度是嚴(yán)重影響成像質(zhì)量的一個(gè)因素，臟的玻片會(huì)使精子和臟物之間難以區(qū)分。蓋玻片厚度會(huì)影響光程，因而影響成像，一般物鏡上都會(huì)有標(biāo)注，通常是0.7毫米厚的蓋玻片最適宜。

玻片腔室厚度過大會(huì)導(dǎo)致視野有多層精子，精子運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)為明顯的三維運(yùn)動(dòng)，當(dāng)精子不處于焦平面時(shí)成像不清晰，從而影響精子識(shí)別。而當(dāng)精子在不同層之間來回穿梭時(shí)會(huì)導(dǎo)致精子跟蹤失敗。

（3）攝像頭與相機(jī)驅(qū)動(dòng)。對(duì)于攝像頭來說，分辨率和信噪比是十分重要的參數(shù)。分辨率越高，信噪比越高，則成像越清晰，越有利于精子識(shí)別。但過高分辨率會(huì)導(dǎo)致圖像數(shù)據(jù)量過大，增大計(jì)算機(jī)處理工作量，降低分析速率，一般來說，在物鏡放大基礎(chǔ)上，相機(jī)的分辨率應(yīng)該達(dá)到1微米/像素以內(nèi)，否則看不見精子尾部。曝光時(shí)間也會(huì)影響成像質(zhì)量，曝光時(shí)間太短，則獲得的信息不足，圖像模糊；曝光時(shí)間過長(zhǎng)，由于精子是運(yùn)動(dòng)的，會(huì)導(dǎo)致精子重影，也會(huì)使圖像模糊。

一般來說，應(yīng)該使顯微鏡光照盡量強(qiáng)一些，以盡量縮短曝光時(shí)間。

通過對(duì)相機(jī)參數(shù)進(jìn)行合理調(diào)整和設(shè)置，或者專門對(duì)采集到的數(shù)據(jù)進(jìn)行增強(qiáng)和降噪，都能夠提升圖像質(zhì)量。

2.震動(dòng)。由于精子本身尺寸只有幾微米，實(shí)驗(yàn)臺(tái)幾微米的震動(dòng)都會(huì)明顯影響精子的運(yùn)動(dòng)軌跡，導(dǎo)致本來靜止的精子表現(xiàn)出活動(dòng)跡象，而活動(dòng)精子VCL也會(huì)略微增大。因此放置顯微鏡的操作臺(tái)應(yīng)該平穩(wěn)防震。

3.溫度。一定范圍內(nèi)，溫度越高精子活躍度越高。但是由于載物臺(tái)中間要留出光通道，中間有空槽，恒溫載物臺(tái)在這個(gè)位置溫度也會(huì)比其他位置低。載玻片越薄，經(jīng)載玻片傳導(dǎo)的熱量越少，中間的溫度也就越低。因此應(yīng)該保證載物臺(tái)中央溫度達(dá)到規(guī)定的37℃～38℃。

4.精子面密度。面密度是指單位面積的精子數(shù)，影響面密度的因素包括精子密度和腔室厚度。密度越大、腔室厚度越大，則精子面密度越大，精子之間的距離也就越小。精子間距越小，則精子碰撞的概率越大，死精子越有可能被當(dāng)成活精子，精子軌跡跟蹤失誤的概率也越大。同時(shí)精子間距越小，當(dāng)精子間距小于精子在兩幀時(shí)間間隔內(nèi)的運(yùn)動(dòng)距離時(shí)，精子就很可能匹配錯(cuò)誤。

5.幀率。幀率是攝像頭指每秒鐘獲取的圖像數(shù)量。幀率受限于曝光時(shí)間和攝像頭的性能。在攝像頭允許范圍內(nèi)，最大幀率＝1秒/曝光時(shí)間。幀率越高，則相鄰兩幀中精子移動(dòng)的距離就越小，越不容易將兩個(gè)相鄰的精子錯(cuò)配。

6.分析時(shí)長(zhǎng)。精子運(yùn)動(dòng)軌跡是彎彎曲曲的，沒有完全呈直線運(yùn)動(dòng)的。分析時(shí)間越長(zhǎng)，則精子軌跡呈現(xiàn)的越全面，時(shí)間越短越不容易反映精子的實(shí)際軌跡。對(duì)于圓弧形運(yùn)動(dòng)或者轉(zhuǎn)圈的精子來說尤其明顯。當(dāng)時(shí)間很短時(shí)，精子近似呈直線運(yùn)動(dòng)，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，圓弧越來越明顯，直線性越來越低，直到最后呈圓圈狀。不同的軌跡計(jì)算出來的參數(shù)不同，也就影響到活力和活率的判定。

分析時(shí)長(zhǎng)并不是越長(zhǎng)越好，分析時(shí)間越長(zhǎng)，精子軌跡交叉的概率越大，出錯(cuò)的概率也越大。并且分析時(shí)間越長(zhǎng)意味著需要分析的幀數(shù)就越多，數(shù)據(jù)處理量越大，分析速率就越慢。

7.算法。各種參數(shù)和指標(biāo)的定義，需要明確為計(jì)算公式和判定邏輯才能使計(jì)算機(jī)能夠執(zhí)行，但是具體參數(shù)和指標(biāo)的定義公式、精子識(shí)別算法、跟蹤算法等多個(gè)方面的內(nèi)容細(xì)節(jié)都會(huì)有多種選擇，并影響到結(jié)果。

（1）參數(shù)定義公式。VCL、VSL和MAD定義比較明確，計(jì)算方法基本一致，LIN＝VSL/VCL，定義也因此是明確的，但這些指標(biāo)受幀率和分析時(shí)長(zhǎng)影響。

但VAP是指平均路徑速率，具體采用哪種平均值或者擬合公式來代表平均路徑各個(gè)廠家都不一樣，并沒有統(tǒng)一的計(jì)算公式。ALH、BCF、STR、WOB等參數(shù)都是在平均路徑的基礎(chǔ)上計(jì)算的，由于平均路徑的計(jì)算方法沒有統(tǒng)一的公式，這些參數(shù)也就沒有統(tǒng)一的計(jì)算公式。并且VAP、ALH、BCF、STR、WOB也受幀率和分析時(shí)長(zhǎng)的影響。

（2）指標(biāo)定義。對(duì)于目測(cè)方法來說，前向精子是綜合多個(gè)信息來判定的，不僅僅是精子呈前向運(yùn)動(dòng)，還有是不是主動(dòng)運(yùn)動(dòng)而不是飄動(dòng)的。但是怎樣的精子算前向的，每個(gè)人都有自己的判定標(biāo)準(zhǔn)，并且是個(gè)模糊的標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)于計(jì)算機(jī)就必須是明確的。

對(duì)于活力，可以從運(yùn)動(dòng)軌跡的曲率、線性、前向性、平均移動(dòng)角度等一個(gè)或者多個(gè)方面進(jìn)行判定。但是具體選擇哪一個(gè)作為依據(jù)并沒有標(biāo)準(zhǔn)。理論上這些指標(biāo)都是可行的，并且都是相關(guān)的。

對(duì)于活率，精子運(yùn)動(dòng)到什么程度算活動(dòng)的，以VCL、VSL還是VAP作為依據(jù)也是沒有標(biāo)準(zhǔn)的，理論上這些指標(biāo)都是可行的，并且也是相關(guān)的。

對(duì)于視野邊緣的精子，肯定是有精子游入，也有精子游出，這些精子會(huì)改變視野中的精子數(shù)量，并且都是運(yùn)動(dòng)精子，對(duì)活力和活率有一定影響，因此是否考慮這些邊緣位置的精子就會(huì)導(dǎo)致一定的誤差。

對(duì)于密度，視野長(zhǎng)度和寬度一般誤差很小，但是腔室厚度誤差比較大。對(duì)于標(biāo)稱10微米厚的玻片來說，如果加工誤差1微米，則檢測(cè)的密度將會(huì)因此產(chǎn)生10%的誤差。對(duì)于標(biāo)稱20微米厚的玻片來說，如果加工誤差1微米，則檢測(cè)的密度也會(huì)因此產(chǎn)生5%的誤差。

（3）精子識(shí)別。視野邊緣的精子由于顯示不全，會(huì)導(dǎo)致精子識(shí)別失誤。這個(gè)概率為邊緣區(qū)占總視野的面積比例，與精子大小以及視野總面積有關(guān)。精子越小，視野越大，則邊緣精子識(shí)別誤差越小。

雜質(zhì)越多、圖像質(zhì)量越差，則識(shí)別出錯(cuò)的概率越大，識(shí)別誤差也就越大。

（4）精子跟蹤。最簡(jiǎn)單的跟蹤方法是最小鄰域算法，也就是將后一幀圖像中與上一幀距離最近的精子認(rèn)為是同一個(gè)精子，這樣就可以將全部圖像中的精子軌跡建立起來。很顯然，這種算法沒有考慮精子運(yùn)動(dòng)方向和路徑交叉的情況。

由于精子運(yùn)動(dòng)不規(guī)則，構(gòu)建精子實(shí)際路徑，需要預(yù)測(cè)精子的運(yùn)動(dòng)方向，對(duì)精子運(yùn)動(dòng)方向有一定限制。在精子軌跡交叉時(shí)，精子圖像重疊，此時(shí)還需要對(duì)重疊圖像進(jìn)行分割，否則會(huì)導(dǎo)致精子數(shù)量偏低以及軌跡斷掉。

幀率越低，精子在幀與幀之間運(yùn)動(dòng)的距離就長(zhǎng)，越容易被當(dāng)成2個(gè)精子。分析時(shí)長(zhǎng)越長(zhǎng)，軌跡交叉的概率越大。因此幀率越低，分析時(shí)長(zhǎng)越長(zhǎng)，跟蹤的誤差就越大。

即使沒有跟蹤失誤，要構(gòu)建完整的軌跡最少需要幾十幀的圖像，在這段時(shí)間內(nèi)肯定有精子游出和游入視野，而這兩部分的精子都不會(huì)有完整的軌跡。如果采納不完整軌跡的結(jié)果，則會(huì)有計(jì)算誤差。如果不采納不完整軌跡，則運(yùn)動(dòng)精子尤其是快速運(yùn)動(dòng)精子的比例將會(huì)降低。視野越小，精子運(yùn)動(dòng)越快，分析時(shí)長(zhǎng)越長(zhǎng)，這個(gè)影響就會(huì)越大。

◎圖 運(yùn)動(dòng)參數(shù)定義示意圖

三、正確使用CASAS

不同廠家的CASAS，由于具體參數(shù)各不相同，不具備嚴(yán)格意義上的可比性。同一廠家的CASAS，由于參數(shù)設(shè)置不同得出的結(jié)論也不具備嚴(yán)格意義上的可比性。對(duì)于這些結(jié)果，由于都是對(duì)活力、活率進(jìn)行檢測(cè)，但是方法不同，可以認(rèn)為它們是有相關(guān)性的不同指標(biāo)，都能反映出精子的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)。

要正確使用CASAS，則應(yīng)該熟悉CASAS的結(jié)構(gòu)和原理，并掌握顯微鏡的調(diào)試使用方法、軟件各項(xiàng)參數(shù)調(diào)好后盡量不動(dòng)，起碼不修改對(duì)結(jié)果有重要影響的幀率、分析時(shí)長(zhǎng)、判定參數(shù)及其閾值。即便要修改，也應(yīng)該在一個(gè)實(shí)驗(yàn)全部結(jié)束以后。