劉元芬

江蘇衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院，南京 211800

痛風(fēng)是一種因體內(nèi)嘌呤代謝紊亂或尿酸排泄減少所引起的晶體性關(guān)節(jié)炎，臨床表現(xiàn)為高尿酸血癥和尿酸鹽結(jié)晶沉積所致的特征性急性關(guān)節(jié)炎［1］。高尿酸血癥與痛風(fēng)密不可分，高尿酸血癥是痛風(fēng)主要的生化基礎(chǔ)［2］。托吡司他（topiroxostat）化學(xué)名為5-（2-氰基-4-吡啶基）-3-（4-吡啶基）-1，2，4-三唑，于2013年6月在日本批準(zhǔn)上市［3］。該藥與目前其他黃嘌呤氧化酶（XOR）抑制劑藥物如別嘌呤醇和非布司他機(jī)制不同，托吡司他具有非嘌呤結(jié)構(gòu)，通過(guò)與XOR 溶劑通道的氨基酸殘基相互作用并形成共價(jià)鍵，抑制形成尿酸前嘌呤分解代謝的最后2個(gè)反應(yīng)，減少尿酸的生成，對(duì)氧化型和還原型的氧化酶抑制劑均有抑制作用［4-6］，因此具有降低尿酸作用強(qiáng)、不良反應(yīng)少、安全性好等優(yōu)點(diǎn)。

目前托吡司他片尚未在我國(guó)上市銷(xiāo)售，按照《藥品注冊(cè)管理辦法》分類(lèi)，屬新藥3.1類(lèi)，托吡司他含量測(cè)定方法、溶出度一致性的研究對(duì)其上市進(jìn)行臨床試驗(yàn)非常重要［7］。因此本研究仿照原研制劑自制托吡司他片，并采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定自制仿制片與原研片中托吡司他的含量，同時(shí)建立托吡司他溶出度測(cè)定方法學(xué)，比較原研藥和自制片劑在50 g·L－1十 二 烷 基 硫 酸 鈉（SDS）水 溶 液、0.1 mol·L－1鹽酸 溶液、10 g·L－1SDS 醋酸溶 液（p H4.0）以及p H6.8磷酸鹽緩沖液（PBS）4種溶出介質(zhì)中的溶出度，采用相似因子（f2）評(píng)價(jià)原研藥片和自制仿制藥片的溶出曲線(xiàn)相似度，為后續(xù)的質(zhì)量控制及體內(nèi)研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

20AD 高效液相色譜儀，島津SPD-20A 檢測(cè)器和UV-1780紫外分光光度計(jì)，均購(gòu)自日本島津公司；AE-240電子分析天平（十萬(wàn)分之一，瑞士梅特勒公司）；ZRS-8智能溶出儀（天津大學(xué)無(wú)線(xiàn)電廠）。

1.2 試藥

乳糖（上海華茂藥業(yè)有限公司）；微晶纖維素，羥丙基纖維素，硬脂酸鎂和交聯(lián)羧甲基纖維素鈉，均購(gòu)自安徽山河藥用輔料股份有限公司；乙腈為色譜純，購(gòu)自美國(guó)Fisher公司；磷酸、氫氧化鈉等試劑均為分析純，均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 托吡司他片的制備

參照原研藥品說(shuō)明書(shū)［8］，將乳糖30 g、微晶纖維素15 g、羥丙基纖維素0.7 g和交聯(lián)羧甲基纖維素鈉1.75 g過(guò)80目篩備用；稱(chēng)取托吡司他20 g，用氣流粉碎機(jī)粉碎。按照處方量稱(chēng)取粉碎好的托吡司他，乳糖、微晶纖維素、羥丙基纖維素和交聯(lián)羧甲基纖維素鈉（內(nèi)加）置濕法混合顆粒機(jī)中混合，攪拌速度為100 r·min－1，切碎速度設(shè)為低速，混合時(shí)間為5～10 min；加純化水適量，混合攪拌5～10 min，前2 min攪拌速度為100 r·min－1，切碎速度設(shè)為低速，后3～10 min攪拌速度為200 r·min－1，切碎速度設(shè)為高速，出料。將所制軟材經(jīng)多功能整粒機(jī)（20目）制濕顆粒，60℃干燥，（24目）進(jìn)行整粒。將顆粒與交聯(lián)羧甲基纖維素鈉1.75 g（外加）和潤(rùn)滑劑硬脂酸鎂0.35 g加入，壓片即得。共制得仿制的托吡司他片1 000片（規(guī)格：20 mg）。

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相為10 g·L－1磷酸溶液（用氫氧化鈉調(diào)節(jié)p H 值至3.0）-乙腈（75∶25）；檢測(cè)波長(zhǎng)為275 nm［8］；理論塔板數(shù)按托吡司他峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。

2.2.2 測(cè)定法 取本品20片，研細(xì)，稱(chēng)取適量，精密稱(chēng)定，加0.1 mol·L－1鹽酸溶液2 m L，再加甲醇適量超聲溶解，并用甲醇定量稀釋制成每1 m L 中約含托吡司他0.05 mg的溶液，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液，精密量取20μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取托吡司他對(duì)照品，精密稱(chēng)定，同法測(cè)定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，即得自制托吡司他片中的藥物含量。共測(cè)定6批托吡司他片中的藥物含量，每批平行測(cè)定3 次。經(jīng)計(jì)算得6 批樣品的平均藥品含量為100.32%±0.40%。見(jiàn)表1。

表1 6批仿制托吡司他片樣品含量測(cè)定結(jié)果（±s，n＝3）Tab.1 Content determination results of 6 batches of self-made Topiroxostat Tablets samples（±s，n＝3）

表1 6批仿制托吡司他片樣品含量測(cè)定結(jié)果（±s，n＝3）Tab.1 Content determination results of 6 batches of self-made Topiroxostat Tablets samples（±s，n＝3）

批號(hào) 含量1 2 3平均含量2020082101 100.35% 100.12% 99.87% 100.11%2020082201 99.96% 99.82% 100.01% 99.93%2020082202 100.60% 100.39% 99.76% 100.25%2020082301 99.81% 99.83% 100.40% 100.01%2020082302 101.06% 101.02% 100.67% 100.92%2020082303 100.56% 100.57% 100.98% 100.70%平均含量 100.39%±0.46% 100.29%±0.47% 100.28%±0.48%100.32%±0.40%

2.3 溶解度試驗(yàn)

參照《中華人民共和國(guó)藥典》（以下簡(jiǎn)稱(chēng)《中國(guó)藥典》）2020年版二部凡例實(shí)驗(yàn)［9］。將托吡司他原料藥研細(xì)，稱(chēng)取本品細(xì)粉適量，置于具塞錐瓶中，分別加相應(yīng)溶液溶解，置于20℃±5℃環(huán)境中，每隔5 min振搖30 s，在30 min內(nèi)觀察溶解情況，以在溶液中看不到沉淀時(shí)，即認(rèn)為完全溶解，最小漏槽體積按最高劑量溶解體積的3倍計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 托吡司他原料藥在不同p H 值緩沖液中的溶解度Tab.2 Solubility of topiroxostat API in different p H buffers

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，托吡司他原料藥的溶解度受p H 值影響很大。

2.4 溶出度測(cè)定方法的建立

2.4.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 取托吡司他對(duì)照品適量，用適量的0.1 mol·L－1鹽酸溶液溶解后，再用各溶出介質(zhì)稀釋成含托吡司他6μg·m L－1的溶液，按照紫外-可見(jiàn)分光光度法進(jìn)行掃描，50 g·L－1SDS水溶液、0.1 mol·L－1鹽酸溶液、p H4.0 醋 酸鹽緩沖 液（含10 g·L－1SDS）和p H6.8 PBS中藥物的最大吸收波長(zhǎng)分別為284、279、275、276 nm。測(cè)得的最大吸收波長(zhǎng)將作為后續(xù)檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.4.2 藥物在各溶出介質(zhì)中的工作曲線(xiàn) 精密稱(chēng)取托吡司他對(duì)照品20 mg，置于100 m L 量瓶中，加0.1 mol·L－1鹽酸溶液及甲醇適量溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)溶液母液。分別精密量取母液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 m L，置于100 m L 量瓶中，用各溶出介質(zhì)稀釋至刻度，搖勻，分別制成含托吡司他 2、4、6、8、10μg·m L－1的系列質(zhì)量濃度溶液。

取上述溶液，以各溶出介質(zhì)為空白，照紫外-可見(jiàn)分光光度法（參考《中國(guó)藥典》四部）在各溶出介質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)處分別測(cè)定其吸光度值A(chǔ)，以吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度C為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算回歸方程。見(jiàn)表3。

表3 托吡司他在各溶出介質(zhì)中的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Tab.3 Standard curves of topiroxostat in different dissolution media

2.4.3 各溶出介質(zhì)中的藥物穩(wěn)定性 精密稱(chēng)取托吡司他對(duì)照品適量，用0.1 mol·L－1鹽酸溶液溶解，再用各溶出介質(zhì)定量稀釋成質(zhì)量濃度約為6μg·m L－1的樣品溶液。按照紫外-可見(jiàn)分光光度法，分別于0、1、2、3、4、5、6、7、8 h，在各溶出介質(zhì)最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度值A(chǔ)。結(jié)果顯示，托吡司他在各溶出介質(zhì)中放置8 h均穩(wěn)定。見(jiàn)表4。

表4 托吡司他在各溶出介質(zhì)中不同時(shí)間的吸光度值A(chǔ)Tab.4 The absorbance value of topiroxostat at different times in different dissolution media

2.4.4 溶出精密度實(shí)驗(yàn) 取本品2個(gè)批次的片劑各1片（批號(hào)：20200818、20200816），按照“溶出度”項(xiàng)下的測(cè)定方法操作，45 min 時(shí)，取溶出液，經(jīng)0.45μm濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液4 m L，置于10 m L 量瓶中，用溶出介質(zhì)50 g·L－1SDS水溶液稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液，各平行配制6份。按照紫外-可見(jiàn)分光光度法，分別在284 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值A(chǔ)。結(jié)果表明，該溶出度測(cè)定法精密度良好，RSD 值為0.28%。

2.4.5 濾膜吸附實(shí)驗(yàn) 取“溶出精密度實(shí)驗(yàn)”項(xiàng)下20200816批樣品的溶出液適量，采用高速離心法，取上清液2.5 m L，置于20 m L 量瓶中，用溶出介質(zhì)50 g·L－1SDS水溶液稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液1；另取“溶出精密度實(shí)驗(yàn)”項(xiàng)下20200816 批的溶出液適量，分別經(jīng)0.45μm 的微孔濾膜（水系和有機(jī)系）過(guò)濾，取續(xù)濾液2.5 m L，置于20 m L 量瓶中，用水稀釋至刻度，混勻，作為供試品溶液2和3。

分別取供試品溶液1、2、3，按照紫外-可見(jiàn)分光光度法，在284 nm 波長(zhǎng)處分別測(cè)定吸光度值A(chǔ)。測(cè)得平均吸光度值為0.616，RSD 值為0.001 4。結(jié)果表明，與離心處理的樣品相比，水系和有機(jī)系濾膜過(guò)濾的樣品的吸光值A(chǔ)基本無(wú)差異，由此可見(jiàn)，濾膜過(guò)濾對(duì)樣品溶液無(wú)吸附作用，采用濾膜過(guò)濾不會(huì)影響溶出度的測(cè)定。

2.4.6 回收率試驗(yàn) 分別精密稱(chēng)取托吡司他對(duì)照品約0.10（50%）、0.16（80%）、0.22 g（110%），置于①、②和③號(hào)研缽中，再取專(zhuān)屬性項(xiàng)下的混合空白輔料，分別精密稱(chēng)取空白輔料約0.5 g（約相當(dāng)于20 mg片劑的10片輔料量），置于3個(gè)研缽中，研勻。從①號(hào)研缽中精密稱(chēng)取細(xì)粉3份（約含托吡司他10.0 mg）；從②號(hào)研缽中精密稱(chēng)取細(xì)粉3 份（約含托吡司他16.0 mg）；從③號(hào)研缽中精密稱(chēng)取細(xì)粉3份（約含托吡司他22.0 mg）。將上述9 份細(xì)粉分別置于100 m L量瓶中，加溶出介質(zhì)50 g·L－1SDS水溶液適量，超聲15 min，用溶出介質(zhì)稀釋至刻度，搖勻；取上述樣品溶液，經(jīng)0.45μm 的微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液2 m L，置于50 m L量瓶中，加溶出介質(zhì)定量稀釋至刻度，即得樣品溶液。

另取托吡司他對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加0.1 mol·L－1鹽 酸 溶 液 適 量 溶 解，用 溶 出 介 質(zhì)50 g·L－1SDS水溶液定量稀釋制成每1 m L 約含托吡司他8μg·m L－1的對(duì)照品溶液。按照紫外-可見(jiàn)分光光度法，在284 nm 波長(zhǎng)處分別測(cè)定吸光度值A(chǔ)。計(jì)算回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。結(jié)果表明，分別加入相當(dāng)于藥物制劑含量50%、80%、110%時(shí)，托吡司他的回收率為98.3%～101.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.30%，符合測(cè)定要求，說(shuō)明本方法可以準(zhǔn)確地測(cè)出溶出液中托吡司他的含量。

表5 托吡司他藥物回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.5 Results of topiroxostat recovery test

2.4.7 溶出轉(zhuǎn)速的選擇 將溶出轉(zhuǎn)速分別設(shè)置為槳法50 r·min－1和75 r·min－1，其余溶出條件不變，將原研藥品分別置于水溶液、含50 g·L－1SDS水溶液、p H4.0醋酸鹽緩沖液和p H6.8PBS 中觀察溶出行為。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)速對(duì)托吡司他片溶出行為影響不大。因此選擇50 r·min－1槳法作為溶出轉(zhuǎn)速。見(jiàn)表6。

表6 不同轉(zhuǎn)速下原研藥片藥物的溶出度Tab.6 The drug dissolution of the original Topiroxostat Tablets at different speeds

2.5 溶出一致性評(píng)價(jià)

2.5.1 溶出度的測(cè)定 取本品，按照溶出度測(cè)定法（《中國(guó)藥典》2020年版四部），以900 m L各種溶液為溶出介質(zhì)，轉(zhuǎn)速為50 r·min－1，依法操作，45 min時(shí)，取續(xù)濾液4 m L，置于量瓶中，加溶出介質(zhì)稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液；按照紫外-可見(jiàn)分光光度法，在最大吸收波長(zhǎng)處分別測(cè)定吸光度值A(chǔ)。另取托吡司他對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加0.1 mol·L－1鹽酸溶液及甲醇適量溶解，再用各溶出介質(zhì)定量稀釋制成每1 m L 約含托吡司他8μg·m L－1的對(duì)照品溶液，同法測(cè)定，計(jì)算每片不同時(shí)間藥物累積溶出百分率。見(jiàn)表7。

表7 不同溶出介質(zhì)中仿制片和原研片的溶出度比較Tab.7 Comparison of the dissolution profiles of self-made tablets and original tablets in different dissolution media

2.5.2 相似度計(jì)算 利用公式計(jì)算并比較仿制藥和原研藥溶出曲線(xiàn)相似度［10-12］。

公式中T和R分別為仿制藥和原研藥的各取樣點(diǎn)的平均溶出度，n為取樣點(diǎn)個(gè)數(shù)，當(dāng)f2因子數(shù)值計(jì)算結(jié)果大于50，可以認(rèn)為兩者在溶出介質(zhì)水中溶出度曲線(xiàn)相似。在50 g·L－1SDS水溶液、0.1 mol·L－1鹽酸溶液、p H4.0醋酸鹽緩沖液（含10 g·L－1SDS）和p H6.8PBS的相似因子結(jié)果分別為76.16、90.54、68.18、58.07。但由于在0.1 mol·L－1鹽酸溶液中，藥物釋放太快，因此綜合考慮選擇50 g·L－1SDS水溶液作為托吡司他仿制藥質(zhì)量控制的溶出介質(zhì)。

3 結(jié)論

托吡司他仿制片目前在我國(guó)并未上市，文獻(xiàn)多報(bào)道合成方法［13-14］和雜質(zhì)的檢測(cè)方法［15-16］，目前溶出度一致性評(píng)價(jià)并未見(jiàn)報(bào)道，但是一致性評(píng)價(jià)對(duì)仿制藥的開(kāi)發(fā)非常重要。本研究首先按照原研藥的相關(guān)資料制備了托吡司他片，并建立了托吡司他溶出度測(cè)定方法。最后選擇4種溶出介質(zhì)對(duì)自制片和原研藥溶出相似度進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，自制仿制藥片和原研藥在4種溶出介質(zhì)中的溶出度曲線(xiàn)相似因子均高于50，進(jìn)一步證明了自制托吡司他仿制片與原研藥在體外溶出實(shí)驗(yàn)中，質(zhì)量近似。綜合考慮取樣點(diǎn)數(shù)量和相似因子，最終選擇50 g·L－1SDS水溶液作為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的溶出介質(zhì)。綜上所述，托吡司他溶出度測(cè)定方法精密度、準(zhǔn)確度和靈敏度高；經(jīng)檢測(cè)自制托吡司他片與原研藥溶出行為一致，這些結(jié)果為托吡司他仿制藥的進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。