余 松，劉 悅，袁 晨，陳湘宏，楊 芳

(1.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，青海 西寧 810001；2.煙臺(tái)大學(xué)，山東 煙臺(tái) 264005)

沙棘(HippophaerhamnoidesLinn.)作為一種藥食同源植物,具有利肺止咳、利心臟血脈、開胃舒胸、活血化瘀、壯陰升陽等功效,具有很高的應(yīng)用價(jià)值[1].沙棘主要生長在青海、新疆、甘肅、西藏、寧夏等16個(gè)省[2-3].據(jù)報(bào)道，沙棘在抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗炎、降血糖等方面具有良好的藥理活性，特別是沙棘黃酮具有良好抗氧化作用[4-8].人體在代謝過程中會(huì)產(chǎn)生大量的自由基，這些自由基會(huì)對細(xì)胞和組織造成氧化損傷，進(jìn)而導(dǎo)致炎癥性疾病、心血管疾病和衰老等疾病發(fā)生[9-11].而自由基抑制劑可能是預(yù)防或延緩這些疾病的重要手段.因此，從天然來源中分離出自由基抑制劑將有助于探索氧化應(yīng)激與人類疾病之間的關(guān)系.本研究以DPPH自由基為靶標(biāo)，采用在線HPLC-DPPH活性篩選系統(tǒng)，高效快速地從沙棘中快速分離純化具有抗氧化活性的黃酮類化合物.

1 儀器與材料

1.1 主要儀器

在線HPLC-DPPH檢測系統(tǒng)使用島津LC10AD和LC-16兩臺(tái)儀器.制備型高效液相系統(tǒng)(江蘇漢邦科技有限公司);Waters ZQ 2000質(zhì)譜儀(美國沃特斯儀器公司)；BrukerAvance 600 MHz 核磁共振儀(德國布魯克儀器公司).

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

DPPH購于Sigma-Aldrich(Steinheim,Germany).沙棘果實(shí)采自青海省同仁市同仁縣,由青海大學(xué)楊仕兵副教授鑒定為沙棘(HippophaerhamnoidesLinn.).該標(biāo)本(編號(hào)6323210517002LY)保存在青海大學(xué)藥學(xué)系標(biāo)本室.

2 方法

2.1 色譜條件

樣品前處理色譜條件為：流動(dòng)相由水和甲醇組成，0～270 min,0～100%甲醇，流速57 mL/min，檢測波長210 nm.Fr4在LC16上色譜條件設(shè)置：流動(dòng)相由0.1%甲酸水和甲醇組成，流速為1 mL/min，梯度洗脫為0～60 min,10%～65%甲醇.Fr4-1在LC16上色譜條件設(shè)置：流動(dòng)相由0.1%甲酸水和甲醇組成，流速為1 mL/min,梯度洗脫為0～30 min,40%～90%甲醇.Fr4-1制備色譜條件：流動(dòng)相由0.1%甲酸水和甲醇組成,等度洗脫為0～30 min,38%甲醇，流速19 mL/min.

2.2 提取與分離

將采集的果實(shí)經(jīng)榨汁過濾，濾渣烘干后用70%乙醇采用超聲提取30分鐘后離心，取上清液減壓濃縮干燥.取提取物60 g用甲醇溶解，將其與聚酰胺(120 g)混合,在烘箱中干燥.使用聚酰胺中壓色譜柱(49×460 mm)對最終干燥的聚酰胺混合物進(jìn)行前處理，得到目標(biāo)餾分Fr4.使用在線HPLC-DPPH系統(tǒng)和ReproSil-Pur C18 AQ(4.6×250 mm,5 μm)分析柱對Fr4中的活性峰進(jìn)行識(shí)別.樣品溶液經(jīng)島津LC16在210 nm波長下檢測后流入LC10AD并與DPPH混合.由于樣品溶液中存在的自由基抑制劑對DPPH的清除作用會(huì)造成在517 nm處吸收值降低從而形成倒峰.根據(jù)文獻(xiàn)進(jìn)行優(yōu)化后[12]，確定LC10AD以DPPH濃度為25 μg/mL乙醇溶液為流動(dòng)相，流速為0.8 mL/min.色譜數(shù)據(jù)在210 nm波長下記錄，抗氧化活性數(shù)據(jù)在517 nm波長下記錄.在確定Fr4中的活性峰后，使用ReproSil-Pur C18 AQ(20×250 mm,5 μm)制備柱，在漢邦制備型高效液相上對Fr4中的活性峰進(jìn)行分離制備.制備色譜條件與分析條件相同，制備色譜流速19 mL/min.得到的目標(biāo)餾分Fr4-1在ACE C18 Amide(4.6×250 mm,5 μm)分析柱上對其進(jìn)行活性篩選.色譜數(shù)據(jù)在210 nm波長下記錄.LC10AD的色譜條件與上述相同.

在確定Fr4-1中的活性峰后，采用島津高效液相對Fr4-1制備條件進(jìn)行優(yōu)化.根據(jù)優(yōu)化的色譜條件在漢邦制備型高效液相上對Fr4-1中活性峰進(jìn)行分離制備，色譜柱為ACE C18 Amide(20×250 mm,5 μm)制備柱.Fr4-1經(jīng)制備后得到Fr4-1-1.之后使用ACE C18 Amide分析柱對Fr4-1-1的純度及自由基抑制劑活性進(jìn)行驗(yàn)證.Fr4-1-1色譜條件與Fr4-1活性篩選條件相同.

3 結(jié)果

3.1 沙棘提取物經(jīng)中壓色譜的前處理

利用聚酰胺中壓柱對沙棘提取物進(jìn)行預(yù)處理，可以使目標(biāo)成分得到較好的富集.同時(shí)，其成本低并且上樣量大，可提高分離效率，使之后的分離任務(wù)更加簡單.最終得到目標(biāo)餾分Fr4(2.28 g).分離裝置和分離色譜圖如圖1.

圖1 中壓色譜分離裝置圖和聚酰胺中壓色譜對粗提物前處理色譜圖

3.2 在線生物活性指導(dǎo)下的分離制備

通過在線HPLC-DPPH系統(tǒng)與制備型高效液相結(jié)合，從而能夠準(zhǔn)確識(shí)別并快速分離Fr4中的活性峰.其活性篩選色譜圖和分離制備色譜圖如圖2、圖3.

圖2 A、B分別為Fr4的分析色圖譜(210 nm)及自由基清除圖譜(517 nm) 圖3 A、B分別為Fr4的分析色譜圖(210 nm)和制備色譜圖(210 nm)

經(jīng)過制備后得到餾分Fr4-1(65.04 mg)，利用在線HPLC-DPPH篩選系統(tǒng)對Fr4-1活性峰進(jìn)行快速識(shí)別(如圖4).之后對Fr4-1制備色譜條件進(jìn)行優(yōu)化，并結(jié)合在線活性篩選結(jié)果將其中的活性峰分離純化(如圖5).最終得到純度較高的DPPH抑制劑Fr4-1-1(18.06 mg).

圖4 A、B分別為Fr4-1的分析圖譜(210 nm)及自由基清除圖譜(517 nm) 圖5 A、B分別為Fr4-1的分析色譜圖(210 nm)和制備色譜圖(210 nm)

3.3 自由基抑制劑的純度評估和結(jié)構(gòu)鑒定

通過純度與活性驗(yàn)證可知化合物Fr4-1-1的純度大于95%，且對DPPH具有抑制作用(圖6).把ESI-MS和NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)中公布的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，并對Fr4-1-1進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定及波譜信息歸屬.

圖6 A、B分別為化合物Fr4-1-1分析圖譜(210 nm)及自由基清除圖譜(517 nm)

化合物Fr4-1-1：黃色粉末；ESI-MSm/z：625.30 [M-H]-，分子式C27H30O17；1H-NMR (DMSO-d6,600 MHz):δH7.16 (2H,s,H-2',H-6'),6.34 (1H,d,J=2.0 Hz,H-8),6.17 (1H,d,J=2.0 Hz,H-6);3-glc:5.39 (1H,d,J=7.8 Hz,H-1''),3.73 (1H,br d,J=11.4 Hz,H-6''a);6''-rha:4.39 (1H,d,J=1.5 Hz,H-1'''),3.37 (1H,dd,J= 3.3,1.5 Hz,H-2'''),1.00 (3H,d,J= 6.2 Hz,H-6''').13C-NMR (DMSO-d6,150 MHz):δC177.3 (C-4),164.1 (C-7),161.2 (C-5),156.4 (C-9),156.3 (C-2),145.4 (C-3',C-5'),136.6 (C-4'),133.4 (C-3),120.1 (C-1'),108.5 (C-2',C-6'),103.9 (C-10),98.6 (C-6),93.4 (C-8);3-glc:100.9 (C-1''),73.9 (C-2''),76.5 (C-3''),70.0 (C-4''),76.1 (C-5''),67.1 (C-6'');6''-rha:100.7 (C-1'''),70.4 (C-2'''),70.5 (C-3'''),71.8 (C-4'''),68.2 (C-5'''),17.7 (C-6''').上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[13]，故鑒定化合物Fr4-1-1為Myricetin 3-O-rutinoside.

4 結(jié)論

本研究以在線HPLC-DPPH活性篩選系統(tǒng)為導(dǎo)向并結(jié)合反相液相色譜,進(jìn)而快速高效地從沙棘中識(shí)別并分離純化得到DPPH抑制劑.采用ESI-MS和NMR對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，為植物藥理活性進(jìn)一步研究和從天然產(chǎn)物中快速制備具有抗氧化活性的黃酮類化合物提供參考.