李 菊，楊曉莉，楊東亮，畢冬琳，張瀟文，劉方程，李瓊毅，柏家林

(1.西北民族大學 生物醫(yī)學研究中心生物工程與技術國家民委重點實驗室，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030)

兔出血癥(Rabbit hemorrhagic disease,RHD)俗稱“兔瘟”，是兔類的一種急性、暴發(fā)性傳染病，該病的病原體是兔出血癥病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV)[1].RHDV通過口腔、鼻腔或結膜途徑傳播，感染兔通常死于暴發(fā)性肝衰竭(Fulminant hepatic failure，F(xiàn)HF)，血清、肝臟和脾臟等組織中細胞因子增加[2].RHDV屬于杯狀病毒科(Calicivirus)兔病毒屬(Lagovirus)，為單股正鏈無囊膜RNA病毒，核酸穩(wěn)定性高[3].目前，已鑒定出4個RHDV基因型[4]，其中RHDV(GI.1)、RHDV2(GI.2新變異型)是較為常見的毒株[5].RHDV較RHDV2宿主相對單一，但致死性更高[6].成年兔感染RHDV后死亡率接近100%，而免疫系統(tǒng)不成熟的幼兔對RHDV卻表現(xiàn)出普遍抗性[7].

研究表明，細胞因子(Cytokine,CK)在調節(jié)炎癥反應和抗病毒免疫中發(fā)揮著重要作用，其異常水平可能導致炎癥和免疫反應失調，會放大RHDV引起的FHF[8-9].以往研究報道，感染RHDV的成年兔血清中TGF-β、IL-10水平升高[10]，隨后相繼發(fā)現(xiàn)感染成年兔血清中IL-10、TNF-β、GM-CSF[8]和IL-6、IL-8、TNF-α、IFN-γ[9]水平升高.感染幼兔血清中TNF-α、IFNα、IL-6、IL-1和IL-8水平升高，而IL-10和IFN-γ水平無變化[2].免疫幼兔感染RHDV后血清中的IL-6和IL-10水平升高[11]，且感染幼兔在3天內死亡.這些數(shù)據表明，細胞因子參與了急性RHDV感染過程.

在中國，RHDV仍然是家兔死亡的首要病因.由于缺乏RHDV體外培養(yǎng)細胞系，RHDV對幼兔與成年兔致病差異的作用機制至今尚不清晰.因此，探索RHDV感染后幼兔和成年兔血清中細胞因子的水平差異，有助于解釋該病毒感染在成年兔中的致命機制，提示血清中細胞因子在病毒性FHF中的潛在作用.本研究對感染RHDV的幼兔和成年兔血清中白細胞介素8(Interleukin 10，IL-8)、白細胞介素10(Interleukin 10，IL-10)、腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor α，TNF-α)、轉化生長因子β(Transforming growth factor-β，TGF-β)和單核細胞趨化蛋白1(Monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)水平進行檢測，分析幼兔和成年兔在不同感染時間(0、12、24、36、48、60 h)血清中上述細胞因子水平的變化，以期發(fā)現(xiàn)RHDV感染中具有潛在作用的細胞因子，并推測其在RHDV對幼兔和成年兔致病差異中的作用機制，為闡明RHD發(fā)病機制、開發(fā)抗RHDV疫苗提供基礎資料.

1 材料和方法

1.1 病毒分離

本研究病料樣品采集自青海西寧已被診斷為RHDV感染死亡家兔(蔡葵蒸教授團隊).在生物安全柜中，解剖攜帶RHDV病兔尸體，取其肝臟于-80 ℃凍融后加入等體積的PBS于4 ℃充分研磨.在-80 ℃反復凍融3次后，300 g離心10 min取上清，0.22 um濾膜過濾并加入一定量的雙抗，保存于-80 ℃?zhèn)溆?

1.2 病毒鑒定

按照RNA提取試劑盒說明書提取1.1上清中病毒RNA，并利用試劑盒反轉錄成cDNA，保存于-80 ℃?zhèn)溆?參照NCBI中RHDV VP60基因序列(GenBank號：DQ205345.1)，利用Primer 5.0設計VP60引物為F：5’-GAAAATTCATCCGCATCGGT-3’，R：5’-CTCAAAGTCATCACTTGGTCTTGTT-3’，由上海生工公司合成.以cDNA為模板，PCR進行鑒定.鑒定正確的PCR產物純化后與pMD-18T載體連接，送上海生工公司測序.從Genbank中下載5株RHDV2毒株、6株經典RHDV毒株以及兔杯狀病毒(Rabbit calicivirus，RCV)共12株病毒的VP60基因序列.采用MEGA4.1軟件進行同源性分析，并構建遺傳系統(tǒng)發(fā)育樹.

1.3 實驗動物

無RHDV抗體的SPF新西蘭兔(甘肅省水思圓智能科技工程有限公司)：2周齡幼兔6只，隨機分組，每3只一組，編號標記(實驗組幼兔1、2、3，對照組幼兔1、2、3)；3月齡成年兔6只，隨機選擇并分組，每3只一組，編號標記(實驗組成年兔1、2、3；對照組成年兔1、2、3).

1.4 試劑和儀器

兔白細胞介素8(IL-8)、兔白細胞介素10(IL-10)、兔腫瘤壞死因子α(TNF-α)、兔轉化生長因子β(TGF-β)和兔單核細胞趨化因子1(MCP-1)ELISA試劑盒(Ruixin Biotech)，生理鹽水，75%醫(yī)用酒精(山西可利爾生物科技有限公司)，脫毛膏(廣州拜高健康產業(yè)有限公司).LX-200離心機(海門其林貝爾)，902-ULTS超低溫冰箱(Thermo Fisher Scientifi)，Centrifuge 5424R小型高速冷凍離心機(Eppendorf)，酶標儀MK3(Thermo)等.

1.5 動物攻毒和樣品采集

對實驗組成年兔和幼兔進行RHDV攻毒試驗，實驗組幼兔和成年兔肌肉注射檢測為RHDV核酸陽性的病兔肝臟懸液1.5 mL，對照組幼兔和成年兔同時注射等量生理鹽水，注射后同等條件下分籠飼喂.在感染后0 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h通過耳緣靜脈采集血樣2 mL，3 000 r/min離心10 min，將血清和紅細胞分離，收集血清至-20 ℃箱儲存?zhèn)溆?，直至兔死?在感染后0 h、6 h、12 h、18 h、24 h、30 h、36 h、42 h、48 h、60 h記錄兔的存活情況，出現(xiàn)死亡病例后采血也隨之終止，60 h后將未死亡兔進行人工處死.

1.6 ELISA檢測血清中細胞因子IL-8、IL-10、TNF-α、TGF-β和MCP-1表達

設置標準品孔和樣品孔，所有樣品以3個重復進行分析.將50 uL不同濃度標準品加入相應的標準孔，樣品孔加入50 uL稀釋好的待測樣本.隨后標準孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的檢測抗體100 uL，37 ℃作用1 h，棄掉孔內液體并用 PBST 洗板5次，加入100 uL TMB顯色，37 ℃避光孵育15 min，最后加入終止液終止反應.15 min內在450 nm波長處測定各孔OD值.在表格中以標準品濃度作橫坐標，對應OD值作縱坐標，繪制出標準品線性回歸曲線，按曲線方程計算各樣本濃度值.

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結果與分析

2.1 RT-PCR檢測

病兔肝臟組織提取RNA進行RT-PCR檢測，結果如圖1所示.瓊脂糖凝膠電泳得到一條474 bp左右的特異性條帶，與目標基因大小一致，證實分離的病毒為RHDV陽性.

M：DNA標準DL5000；1：VP60基因擴增產物

2.2 同源性分析

通過MEGA4.1軟件分析結果顯示(圖2)，擴增的VP60部分序列與Genbank報道的7株經典RHDV(基因型為GI.1)的VP60核苷酸序列一致性高達90.11%～96.21%，與報道的5株RHDV2型(基因型為GI.2)VP60核苷酸序列一致性為84.63%～85.68%.由此可見，本研究分離的RHDV屬于經典毒株，基因型為GI.1.

1～5.兔血性病毒2型毒株；6.兔杯狀病毒毒株；7～12.經典兔血性病毒毒株；13.本實驗室分離的兔出血性病毒毒株

2.3 VP60基因遺傳進化分析

根據進化樹結果可以看出(圖3)，本實驗室分離的毒株與經典毒株RHDV(基因型為GI.1)的親緣關系最為接近，且與2010年中國分離出的毒株(GenBank號：KJ814618DO/China/2010)最為接近，并且他們屬于同一個大的分支，與RHDV2(基因型為GI.2)的親緣關系較遠.

1.本實驗室保存毒株VP60的部分核苷酸序列

2.4 RHDV感染幼兔與健康幼兔,感染成年兔與健康成年兔存活情況

RHDV感染后，幼兔與成年兔存活情況如圖2-4.幼兔感染RHDV后，實驗組與對照組幼兔均未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象.成年兔感染RHDV后在36 h開始死亡，48 h時全部死亡，對照組成年兔無死亡現(xiàn)象.

表1 幼兔和成年兔感染RHDV后的存活情況

2.5 RHDV感染成年兔血清中細胞因子水平分析

成年兔在感染RHDV后36 h開始死亡，因此檢測實驗組與對照組成年兔在0～36 h血清中所選細胞因子水平.結果顯示，實驗組成年兔血清中IL-8、IL-10和TGF-β水平在感染后明顯增加，36 h均達到峰值(P<0.001)(圖4A、B、C).不同的是，IL-8、IL-10在感染的0 h開始增加，TGF-β在12 h開始增加.MCP-1和TNF-α水平在感染的24 h達到峰值(P<0.001)，36 h時仍明顯高于對照組(P<0.01)(圖4D、E)；對照組成年兔血清中IL-8、IL-10、TNF-α、TGF-β和MCP-1水平均無明顯變化(圖2-5).結果表明，成年兔感染RHDV后血清中IL-8、IL-10、TNF-α、TGF-β和MCP-1的水平顯著升高.

圖4 成年兔感染RHDV后血清中細胞因子水平變化

2.6 RHDV感染幼兔血清中細胞因子水平分析

就幼年組而言，由于整個試驗過程中未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，因此檢測了0～ 60 h實驗組與對照組幼兔血清中5種細胞因子的水平變化.結果顯示，實驗組幼兔血清中IL-8水平在24 h顯著增加(P<0.01)，36 h達到峰值(P<0.001)，48 h、60 h仍顯著高于對照組(P<0.05)(圖4A).TNF-α和TGF-β水平變化無明顯規(guī)律(圖5B、C).IL-10、MCP-1水平未出現(xiàn)明顯差異(P>0.05)(圖5D、E).結果表明，幼兔感染RHDV后引起血清中IL-8水平升高.

圖5 幼兔感染RHDV后血清中細胞因子水平變化

2.7 RHDV感染幼兔與成年兔血清中細胞因子水平分析

檢測幼兔和成年兔感染RHDV后0～36 h血清中所選細胞因子表達量.結果顯示，成年兔血清中IL-10、TGF-β的表達量在感染后顯著增加(P<0.001)，幼兔無明顯變化(P>0.05)(圖6A、B).IL-8水平在幼兔和成年兔血清中均明顯增加，且成年兔中IL-8水平顯著高于幼兔(P<0.05)(圖6C).成年兔血清中MCP-1水平在0～36 h內均明顯高于幼兔(P<0.001)(圖6D).特別在幼年組血清中TNF-α水平在0～12 h內遠高于成年兔(P<0.001)，在12～24 h時TNF-α的含量急速增加，并在24 h高于幼兔(P<0.001)，24～36 h內又以相似的速率降低，甚至在36 h低于幼兔(P<0.01)(圖6E).結果表明，幼兔和成年兔感染RHDV后血清中IL-8、IL-10、TNF-α、TGF-β和MCP-1的水平存在差異.

圖6 幼兔與成年兔感染RHDV后血清中細胞因子水平變化

3 討論

RHD的高發(fā)病率和高死亡率對我國的兔養(yǎng)殖業(yè)和野生兔類存在巨大威脅.細胞因子作為抗病毒免疫調節(jié)的重要因子，與病毒性疾病密切相關[8-9].目前，細胞因子在RHDV對幼兔和成年兔致病機制中的作用尚不明確，僅少許研究關注了細胞因子在RHDV感染的幼兔或成年兔中的作用[2,8-9]，目前還沒有研究指出RHDV感染后二者中水平差異的細胞因子，也并未闡明這些細胞因子在RHDV對幼兔和成年兔致病機制中的作用.

IL-8也稱為C-X-C基序趨化因子配體8(C-X-C motif chemokine ligand 8，CXCL8)，是一種促炎趨化因子.臨床研究表明，IL-8不僅促進中性粒細胞和T淋巴細胞向組織浸潤，還能激活核因子κB(Nuclear factor kappa-B，NF-κB)通路，加劇炎癥反應，與慢性病毒性肝炎有關[12].

IL-10也稱為細胞因子合成抑制因子(Cytokine synthesis inhibitory factor，CSIF)，可抑制多種細胞因子的合成而起到抗炎作用.此外，IL-10通過抑制T細胞、自然殺傷細胞(NK)和活化的巨噬細胞功能減輕或阻止炎癥反應產生，但同時抑制了天然免疫應答[13].

MCP-1又稱C-C基序趨化因子配體2(C-C Motif Chemokine Ligand 2，CCL2)，可調節(jié)單核細胞、記憶T淋巴細胞和NK細胞的遷移和浸潤，具有將單核細胞招募到活躍炎癥灶中的趨化活性，參與了抗病毒免疫反應[14].

TNF-α作為先天免疫和細胞免疫反應的中介，其水平升高能夠導致過度的抗病毒免疫反應，這在低致病性流感病毒(x31,H3N2)感染的死亡小鼠[15]中可以觀察到.已知在病毒感染前期TNF-α高水平有利于招募額外的靶單核細胞，因此可以猜測在RHDV感染前期TNF-α水平上升可能會導致過度免疫應答，造成機體的免疫損傷[15].

TGF-β是體內最強的免疫功能抑制細胞因子，其早期的高水平抑制了NK細胞功能和早期病毒控制，加重了新冠病毒(Coronavirus disease 2019 ，COVID-19)感染者疾病進程[16].由此我們猜想TGF-β對RHDV感染兔(5E)可能具有相似的作用，即TGF-β的高水平可能抑制了機體對RHDV的控制與清除，是引起成年兔死亡的潛在因素.

細胞因子作為炎癥反應和免疫反應的主要蛋白，在短期刺激下可誘發(fā)適宜的炎癥反應和免疫反應，而在病毒感染刺激下誘導產生的高水平細胞因子長期作用時可引發(fā)過度的免疫應答，造成機體多器官功能障礙和感染動物的死亡.許多研究顯示，細胞因子的異常水平與嚴重病毒性疾病有關，包括急性肝炎、流感和新冠肺炎等[9,12,15-16].本研究表明，IL-8、IL-10、TNF-α、TGF-β和MCP-1在RHD發(fā)病機制中具有重要作用，幼兔與成年兔對RHDV的不同抗性可能與其水平差異有關.本研究所獲得的結果可能會證明細胞因子在病毒性FHF中的潛在作用.