楊詩雨，施泓如，王曉東，劉瑞妍，倪志翔，佟英偉，劉 成，李 翔，何長久

（華中農業(yè)大學 動物科技學院動物醫(yī)學院／農業(yè)動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室／國家級國際聯(lián)合研究中心，武漢 430070）

胚胎體外生產（IVP）既是人類輔助生殖的技術基礎，也是畜牧業(yè)中提高母畜繁殖潛力、加快品種改良及種質資源保存的重要手段。胚胎發(fā)育效率是制約IVP技術推廣的核心因素。早期胚胎比較脆弱，極易受培養(yǎng)環(huán)境的影響，如滲透壓、溫度、pH值的微小改變都會影響胚胎質量，甚至造成胚胎發(fā)育阻滯。因此，改進培養(yǎng)液配方是優(yōu)化IVP技術的主要手段。無論是在生殖醫(yī)學還是畜牧生產中，被移植的大多是在體外發(fā)育至囊胚階段的胚胎，因為相比更早階段的胚胎，囊胚移植妊娠率較高。正因為如此，囊胚發(fā)育率、囊胚孵化率及囊胚細胞數是評價IVP技術先進性的核心指標。近20年以來，科學家們一直在致力于改進胚胎培養(yǎng)液的成分以提高胚胎存活率和囊胚發(fā)育率。

囊胚腔的形成是胚胎主動攝入水分并儲存在內部的結果。研究表明，桑椹胚細胞膜上的Na／K泵所營造的內外滲透壓梯度差是胚胎攝入水分的主要動力。水分子通過自由擴散或水通道蛋白介導的被動轉運方式不斷進入胚胎內部，導致囊胚腔的形成與擴張。c-型鈉鈦（CNP）是鈉鈦家族的主要成員，與心房鈉鈦和腦鈉肽具有相似的化學結構。研究表明，CNP不僅參與泌尿系統(tǒng)與循環(huán)系統(tǒng)的水鈉轉運，而且還能影響神經膠質細胞中水通道蛋白的表達。越來越多的證據表明，CNP還作為局部信號直接調控哺乳動物生殖活動。在雌性哺乳動物中，CNP不僅可以維持卵母細胞減數分裂阻滯，而且還能促進小鼠早期卵泡的發(fā)育。在雄性動物中，CNP已被證實可以調節(jié)生精作用、精子運動和睪酮合成。有研究報道，CNP處理的牛卵母細胞，經過體外受精或者孤雌激活，胚胎的囊胚率和質量均得到了顯著提高。

鑒于CNP在生殖活動中廣泛的調節(jié)作用，研究者在體外成熟液中添加CNP，顯著提高了卵母細胞的質量。然而，CNP對胚胎體外發(fā)育的影響鮮有報道。研究表明，在胚胎和胎盤中均能檢測到CNP信號，并且妊娠期子宮中CNP基因表達水平比孕前會升高7倍左右。據此推測CNP可能參與了胚胎發(fā)育調控。為了驗證這一推測，本試驗以小鼠為模型，分別在2細胞胚胎和囊胚腔形成階段添加CNP，統(tǒng)計CNP對4細胞率、囊胚率、囊胚成腔率、囊胚腔擴張率、囊胚孵化率、囊胚腔直徑、囊胚腔面積占比及囊胚總細胞數的影響，現報道如下。

1 材料

1.1 試驗動物

3周齡雌性昆明近交系小鼠40只，購自華中農業(yè)大學實驗動物中心，飼養(yǎng)期間保持12 h／12 h的明暗周期變化（08：00—20：00光照），動物房溫度保持22～26℃，自由飲水，自由采食。

1.2 主要試劑

孕馬血清促性腺激素（PMSG）、人絨毛膜促性腺激素（hCG），購自寧波第二激素廠；透明質酸酶、KSOM培養(yǎng)液與石蠟油，購自Sigma-Aldrich（上海）貿易有限公司；DAPI、磷酸鹽緩沖液（PBS）、4%多聚甲醛與防熒光淬滅劑（DABCO），購自武漢塞維爾生物科技有限公司；CNP，購自Med Chem Express公司；卵母細胞操作液（M2液），購自北京邁晨科技公司。

1.3 主要儀器、設備

體視顯微鏡，NIKON公司產品；熒光正置顯微鏡，Olympus公司產品；CO細胞培養(yǎng)箱，Thermo Fisher Scientific公司產品；超凈工作臺，北京亞泰科隆儀器技術公司產品。以上儀器、設備均由華中農業(yè)大學農業(yè)動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室提供。

2 方法

2.1 小鼠超數排卵及配種

雌性小鼠腹腔注射PMSG 5 IU以促進卵泡發(fā)育，46 h后再注射hCG 5 IU。隨后將其與性成熟雄性小鼠進行1∶1合籠，并于次日檢查陰道栓以確定交配情況，檢查發(fā)現見栓30只，將其隨機分成兩批，其中15只小鼠用于2細胞／4細胞轉變階段添加CNP試驗，另外15只用于桑椹胚階段添加CNP試驗。

2.2 體內受精卵的獲取與處理

在hCG注射22 h后，采用頸椎脫臼法處死見栓小鼠并分離輸卵管，在M2操作液中用注射器針頭扎破輸卵管膨大部以釋放受精卵。隨后使用0.3%透明質酸酶溶液去除胚胎周圍多余卵丘細胞，將清洗完畢的受精卵轉移至KSOM 培養(yǎng)液中，并置于5%CO、37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

2.3 胚胎培養(yǎng)

將CNP濃儲液按不同體積分別加到KSOM培養(yǎng)液中，最終CNP濃度為0（對照組）、100μg／L（1組）、200μg／L（2組）。采用微滴法進行胚胎培養(yǎng)，每滴培養(yǎng)液50μL，用石蠟油封閉。當胚胎發(fā)育至2細胞階段時，將2細胞隨機分配到對照組（17枚）、1組（20枚）、2組（21枚）微滴中繼續(xù)培養(yǎng)，隨后統(tǒng)計4細胞率與囊胚率。當胚胎發(fā)育至致密桑椹胚階段時，將桑椹胚隨機分配到對照組（40枚）、1組（38枚）、2組（37枚）微滴中繼續(xù)培養(yǎng)，隨后統(tǒng)計囊胚成腔率、擴張率、孵化率以及囊胚細胞數等指標。

2.4 DAPI染色

使用多聚甲醛固定囊胚，將固定后的囊胚轉移到DAPI染色液中，室溫孵育10 min。用PBS清洗3次后將囊胚轉移至含防熒光猝滅劑的載玻片上，并于熒光顯微鏡下觀察拍照。

2.5 測定項目及數據的統(tǒng)計分析

為研究CNP對囊胚總細胞數的影響，對含不同濃度CNP的培養(yǎng)液中發(fā)育24 h的囊胚進行DAPI染色，并拍照統(tǒng)計各組囊胚總細胞數。

將2細胞在不同濃度CNP的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，24 h后統(tǒng)計4細胞率（4細胞數／2細胞數×100%）；72 h后統(tǒng)計囊胚率（囊胚數／2細胞數×100%］。桑椹胚在不同濃度CNP的培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h后統(tǒng)計囊胚成腔率（囊胚數／桑椹胚數）×100%］、囊胚擴張率（擴張囊胚數／桑椹胚數×100%）、囊胚腔面積占比（囊胚腔面積／囊胚總面積×100%）和囊胚腔直徑；48 h后統(tǒng)計孵化率（孵化囊胚數／桑葚胚數×100%）。

采用Image J軟件測量擴張囊胚的直徑和囊胚腔面積，用IBM SPSSStatistics 24軟件對所得的數據進行差異分析，用GraphPad Prism 8.0.2軟件作圖。多組數據間的顯著性比較采用單因素方差分析，百分率數據采用卡方檢驗及Bonferroni方法進行分析，＜0.05視為兩個數據間差異顯著。

3 結果與分析

試驗首先確定了胚胎發(fā)育至各階段所需的時間。受精卵在體外培養(yǎng)24 h后發(fā)育至2細胞（見圖1A）；48 h后發(fā)育至4細胞（見圖1B）；72 h后發(fā)育至桑椹胚（見圖1C）；96 h后發(fā)育至囊胚（見圖1D），此刻可觀察到擴張囊胚，即囊胚腔擴張至囊胚總面積的1／2以上；120 h后發(fā)育至孵化囊胚（見圖1E）。

圖1 早期胚胎發(fā)育不同階段代表性圖片Fig.1 Representative images of different stages of early embryonic development

3.1 早期胚胎體外發(fā)育各階段的觀察

3.2 2／4細胞轉變階段添加CNP對胚胎發(fā)育的影響

將2細胞隨機分配到含CNP濃度為0，100，200μg／L的微滴中培養(yǎng)，24 h后統(tǒng)計4細胞發(fā)育率（2細胞在不同濃度CNP的培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h后的代表性圖片見圖2），72 h后統(tǒng)計囊胚率。結果表明，與對照組相比，1組4細胞率無顯著差異（52.50% vs 68.42%，＞0.05），2組4細 胞 率 顯 著 降 低（33.3% vs 68.42%，＜0.05），見圖3A。1組和2組的胚胎均無法繼續(xù)發(fā)育至囊胚階段，見圖3B。

圖2 2細胞在不同濃度CNP的培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h后的代表性圖片Fig.2 Representative images of 2-cell cultured in different doses of CNP medium for 24 hours

圖3 2細胞／4細胞轉變階段添加CNP對胚胎發(fā)育的影響Fig.3 Effects of adding CNP on embryonic development at the transition stage from 2-cell to 4-cell

3.3 CNP對小鼠囊胚的成腔與擴張的影響

桑椹胚在不同濃度CNP的培養(yǎng)液中培養(yǎng)的代表性圖片見圖4。與對照組相比，1組囊胚成腔率（83.10% vs 90.28%）、囊胚腔擴張率（56.34% vs 66.67%）、孵化率（15.49% vs 15.28%）、囊胚腔面積占比（50.77% vs 51.99%）和囊胚腔直徑［（86.42±2.76）μm vs（95.29±4.13）μm］均無顯著差異（＞0.05）；而2組囊胚成腔率（43.78% vs 90.28%）、囊胚腔擴張率（17.91% vs 66.67%）、孵化 率（4.48% vs 15.28%）、囊 胚 腔 面 積 占 比（38.15% vs 51.99%）和囊胚腔直徑［（73.30±3.22）μm vs（95.29±4.13）μm］均顯著降低（＜0.05），見圖5。

圖4 桑椹胚在不同濃度CNP的培養(yǎng)液中培養(yǎng)的代表性圖片Fig.4 Representative images of morula cultured in different doses of CNP medium

圖5 CNP對小鼠囊胚成腔與擴張的影響Fig.5 Effects of CNP on the cavity formation and expansion of blastocysts in mouse

3.4 CNP對囊胚總細胞數的影響

DAPI染色代表性圖片見圖6。經統(tǒng)計，1組（41.38±2.71 vs 55.12±3.06）和2組（38.29±2.47 vs 55.12±3.06）囊胚總細胞數與對照組相比均顯著下降（＜0.05），見圖7。

圖6 DAPI染色代表性圖片（標尺＝50μm）Fig.6 Representative images of DAPI staining（scale bar＝50μm）

圖7 桑椹胚在CNP培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h時囊胚總細胞數Fig.7 The total number of blastocyst cells of morula cultured in CNP medium for 24 hours

4 討論與結論

小鼠胚胎早期發(fā)育過程中，合子基因組激活發(fā)生在2細胞階段，若合子基因組激活失敗，就會出現胚胎發(fā)育阻滯的現象。本試驗中，CNP的添加導致2細胞向4細胞胚胎轉變的效率顯著下降，并且CNP組少數發(fā)育至4細胞的胚胎也無法完成后續(xù)發(fā)育。說明CNP對早期胚胎的卵裂可能具有廣泛的抑制作用，但CNP發(fā)揮上述抑制作用的機制尚不清楚。

囊胚腔形成的關鍵在于水分在胚胎內部的積累，水分積累效率越高囊胚發(fā)育越快。因此，囊胚率、囊胚腔擴張率、囊胚擴張等級及囊胚孵化率可以作為囊胚質量評估的形態(tài)學指標。當CNP濃度為100μg／L時，與CNP濃度為0相比，囊胚成腔率、囊胚腔擴張率、囊胚腔面積占比和直徑均呈下降的趨勢，但是差異不顯著（＞0.05）；當CNP濃度繼續(xù)升高至200μg／L時，囊胚成腔率、囊胚擴張率、孵化率、囊胚腔直徑和囊胚腔面積占比繼續(xù)明顯下降，與CNP濃度為0相比差異顯著（＜0.05）。這說明在胚胎培養(yǎng)液中添加CNP對囊胚腔的形成也有抑制作用。相比于體外囊胚，體內囊胚的總細胞數明顯更多。細胞數是評價胚胎細胞周期進展能力和發(fā)育潛能的關鍵指標，研究表明，發(fā)育潛能、著床率、活產率都隨著細胞數的增加而增加。細胞數降低的原因之一可能是發(fā)育停滯或遲緩導致細胞周期延長的結果。本試驗中，添加CNP顯著降低囊胚總細胞數，這說明CNP對早期胚胎發(fā)育潛力具有抑制作用。

50年前，用于胚胎體外培養(yǎng)的培養(yǎng)基問世，經過幾十年的探究，目前已經具有比較成熟的胚胎培養(yǎng)系統(tǒng)，培養(yǎng)液能夠提供胚胎生長所必需的碳水化合物、氨基酸、無機鹽等營養(yǎng)物質和滲透壓維持因子。有研究發(fā)現，在培養(yǎng)液中添加生長因子或多肽有助于提高胚胎發(fā)育的質量，比如添加表皮生長因子、類胰島素一號生長因子等能夠增加囊胚的內細胞團數量，提高囊胚率。CNP不僅具有調節(jié)水鈉轉運的功能，而且還能調控中樞神經系統(tǒng)中水通道蛋白的表達。在小鼠妊娠過程中，在子宮中能檢測到CNP特異性的高表達。鑒于囊胚形成依賴于水分轉運，因此筆者推測CNP可能影響囊胚腔的形成。最終的試驗結果顯示CNP對胚胎體外發(fā)育表現為廣泛的抑制作用，并且主要體現在對卵裂的抑制上。但本研究尚不能排除CNP具有促進囊胚成腔的可能性，因為CNP對卵裂的抑制作用足以掩蓋CNP對囊胚腔形成的促進作用。盡管CNP不具有提高胚胎體外發(fā)育效率的潛力，但本研究的意義在于闡明了CNP在早期胚胎發(fā)育過程中的作用，它可以作為一種有效的胚胎發(fā)育抑制劑。需要指出的是，本研究是采用外源添加的方式來評估CNP對體外胚胎發(fā)育的影響，并不清楚CNP信號缺失后胚胎所受到的影響。這一問題有待在未來的研究中借助基因編輯技術進行深入探討。

本研究證實CNP不僅阻礙小鼠2細胞向4細胞胚胎的轉變，還抑制囊胚腔的形成與擴張，降低囊胚質量。說明CNP是一種早期胚胎發(fā)育的有效抑制分子。