岳明星，簡(jiǎn)偉杰，李 浡，陳 思，危 晴，陳 亮，辛秀蘭

（北京電子科技職業(yè)學(xué)院，北京 100176）

在胚胎發(fā)育中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（Dnmts）起到了關(guān)鍵作用。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3家族中的Dnmt3a、Dnmt3b在成體組織中表達(dá)量很低，在胚胎干細(xì)胞中表達(dá)豐度較高，胚胎干細(xì)胞中Dnmt3a和Dnmt3b失活會(huì)干擾DNA從頭甲基化，小鼠Dnmt3b、Dnmt3a基因突變會(huì)導(dǎo)致胚胎畸形及死亡率升高。Dnmt3a和Dnmt3b的功能在胚胎發(fā)育早期相似，Dnmt1的甲基化作用發(fā)生在植入期，在胚胎發(fā)育過程中起維持甲基化的作用。無論是DNA從頭甲基化還是DNA甲基化的維持都是胚胎發(fā)育的重要環(huán)節(jié)，這可能與不同組織細(xì)胞中不同基因的表達(dá)有關(guān)。另外，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶與早期胚胎植入子宮內(nèi)膜也有一定聯(lián)系，DNMT1、DNMT3A、DNMT3B可以聯(lián)合作用，調(diào)節(jié)E鈣黏素（E-cadherin）的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜對(duì)胚胎的接受能力，這也說明了DNMTs在胚胎發(fā)育中的重要作用，異常的胚胎植入和流產(chǎn)很有可能與DNMTs的異常有關(guān)。

DNA甲基化是指DNA序列上特定的堿基獲得一個(gè)甲基基團(tuán)的化學(xué)修飾過程。它作為一種相對(duì)穩(wěn)定的修飾狀態(tài)，在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下可隨DNA的復(fù)制過程遺傳給新生的子代DNA。這種傳遞主要通過Dnmt1維持，是一種重要的表觀遺傳機(jī)制。在衰老的細(xì)胞中會(huì)出現(xiàn)“DNA甲基化漂移”，即衰老的組織和細(xì)胞中廣泛存在著DNA甲基化程度降低或過甲基化現(xiàn)象。產(chǎn)生這兩種現(xiàn)象的主要原因與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)異常有關(guān)。在人的T淋巴細(xì)胞中Dnmt3a表達(dá)量處于較低水平，且不隨年齡變化而發(fā)生改變；而Dnmt1和Dnmt3b表達(dá)量很高，并呈現(xiàn)出隨年齡增大而降低的趨勢(shì)。這證明DNA甲基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)量下降是導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞甲基化程度下降的原因之一。研究人外周血白細(xì)胞5-甲基胞嘧啶含量時(shí)發(fā)現(xiàn)，人50歲以上組的5-甲基胞嘧啶含量較50歲以下組低，即隨著年齡的增長(zhǎng)甲基胞嘧啶含量呈下降趨勢(shì)；但其下降程度很小，下降速度為每年0.014%。以上研究證明，基因組DNA甲基化水平降低的趨勢(shì)在衰老中是普遍存在的。但在衰老進(jìn)程中同時(shí)伴隨著某些基因啟動(dòng)子局部區(qū)域5-甲基胞嘧啶含量的增加，如雄性大鼠的精子和肝細(xì)胞中核糖體DNA隨著年齡的增大發(fā)生超甲基化，人類小腸隱窩的干細(xì)胞隨年齡增長(zhǎng)發(fā)生高甲基化現(xiàn)象。

越來越多的研究證明，DNA甲基化在機(jī)體和細(xì)胞衰老過程中發(fā)揮重要作用。哺乳動(dòng)物的生殖細(xì)胞和植入前胚胎基因組甲基化經(jīng)歷一個(gè)重編程過程，受精后從親代獲得的配子甲基化模式通過去甲基化作用被擦除，在隨后植入過程中，新的甲基化模式通過從頭甲基化作用被建立。胚胎的甲基化重編程過程對(duì)胚胎的發(fā)育和細(xì)胞全能性的建立具有重要作用。目前，生殖老化對(duì)甲基化重編程過程的影響機(jī)制仍不清楚。

為了研究老化對(duì)小鼠植入前不同時(shí)期胚胎Dnmts表達(dá)量的影響，本試驗(yàn)利用Western-blot方法，分別檢測(cè)了青、老年小鼠2細(xì)胞和4細(xì)胞胚胎、8細(xì)胞和桑椹胚、囊胚的Dnmts表達(dá)量，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及分組

同一批次昆明白小鼠雌性300只、雄性100只，購(gòu)自中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，隨機(jī)分為兩組，一組（100只）為青年組，在青年時(shí)期6～8周齡進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)；另一組（200只）飼養(yǎng)到老年時(shí)期（35～40周齡），為老年組，在35～40周齡重復(fù)青年組所做試驗(yàn)。

小鼠飼養(yǎng)于控溫（20～25℃）、控光［14 h光照（06：00—20：00）和10 h黑暗（20：00—06：00）］環(huán)境中。所有動(dòng)物操作均按照北京市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例相關(guān)規(guī)定執(zhí)行，符合動(dòng)物福利的要求。

1.2 主要儀器及試劑

搖床（型號(hào)為TS-92）、旋渦混合器（型號(hào)為QL-901），購(gòu)自其林貝爾儀器制造有限公司；臺(tái)式冷凍離心機(jī)（型號(hào)為TGL-16），購(gòu)自湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；電泳儀（型號(hào)為DYCZ-24DH），購(gòu)自北京六一生物科技有限公司；轉(zhuǎn)膜儀（型號(hào)為TY-201-01），購(gòu)自南京中科通儀科技有限公司；電子天平、冰箱、液氮罐、pH計(jì)、注射器、大鑷子、吸水紙、記號(hào)筆、槍頭、離心管、剪刀、濾紙、膜、乳膠手套等均為國(guó)產(chǎn)，市購(gòu)；Eppendorf移液器、顯微鏡，市購(gòu)。以上儀器和用品均由北京電子科技職業(yè)學(xué)院生物工程學(xué)院細(xì)胞及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

Dnmt1（A-1001）、Dnmt3a（A-1003）、Dnmt3b（A-1004）、Dnmt3L（A-1005）抗體，購(gòu)自Epigentek公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（20201ES76），購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；Loading buffer、配制M2液所需藥品及其他試劑，均購(gòu)自Sigma公司。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 各時(shí)期胚胎的采集 青年組（6～8周齡）挑選自然發(fā)情的小鼠與8～10周齡正常雄性昆明白小鼠合籠。次日清晨觀察小鼠交配情況，有栓小鼠視為交配成功。交配后見栓雌鼠沖取體內(nèi)胚胎，分別于交配后44～48 h、52～56 h、60～64 h、68～72 h、84～96 h收集2細(xì)胞、4細(xì)胞、8細(xì)胞、桑椹胚和囊胚。將胚胎用M2液清洗3～5次，同時(shí)期每胚胎置于一個(gè)EP管中，-80℃保存，備用；老年組（35～40周齡）挑選自然發(fā)情小鼠，做上述交配及胚胎采集試驗(yàn)。將5個(gè)時(shí)期胚胎分為三類：2細(xì)胞／4細(xì)胞胚胎、8細(xì)胞／桑椹胚、囊胚。

1.3.2 樣品的制備 取青年、老年小鼠每組胚胎各200個(gè)，放入1.5 mL離心管中并加入100μL蛋白裂解液，用玻璃研磨器于冰上勻漿；將勻漿液轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5 mL EP管中，置于冰上15 min，以充分裂解；4℃、12 000 r／min離心10 min；將離心后的上清液分裝轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中。制備電泳樣品，使每個(gè)樣品總蛋白為50～100μg。根據(jù)蛋白濃度計(jì)算各樣品所需取樣量，并與Loading buffer混勻，沸水煮5 min，放入冰盒中快速制冷，備用。上樣前按照BCA蛋白定量試劑盒使用說明書測(cè)定蛋白濃度。

1.3.3 Western-blot 配制12%分離膠，加入四甲基乙二胺（TEMED）后立即搖勻即可灌膠，并用ddHO封膠；凝固后將膠上層水倒去，并用吸水紙將水吸干；配制4%濃縮膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。剩余空間灌滿濃縮膠，將梳子插入濃縮膠中；取1.3.2樣品上樣，電泳。濃縮膠電泳電壓為80 V，分離膠電泳電壓為120 V。待溴酚藍(lán)電泳至膠底部時(shí)終止電泳。

恒流轉(zhuǎn)膜約70 min后，將膜取出放入洗滌緩沖液TBST中洗1次，時(shí)間5 min；用封閉液（TBST緩沖液中含5%脫脂奶粉）將膜浸入，室溫放置1 h；用封閉液將一抗Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b、Dnmt3L按1∶200稀釋，將膜與稀釋后一抗在4℃孵育12 h，孵育結(jié)束后用TBST洗3次，每次5 min；用封閉液將辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（羊抗兔和羊抗鼠）按1∶1 000稀釋后與孵育一抗后的膜37℃共孵育2 h，孵育結(jié)束后用TBST洗3次，每次5 min；ECL曝光，顯影、定影后用Image J軟件分析Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b、Dnmt3L蛋白相對(duì)灰度值。相對(duì)灰度值越大蛋白表達(dá)量越大，反之亦然，即相對(duì)灰度與蛋白表達(dá)量成正比。

1.4 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)均采用SPSS 12.0軟件的獨(dú)立樣本檢驗(yàn)進(jìn)行分析。＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 2細(xì)胞／4細(xì)胞胚胎中Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b、Dnmt3L在老化過程中表達(dá)量的變化

通過Western-blot方法測(cè)定青年、老年小鼠2細(xì)胞和4細(xì)胞胚胎中4種主要DNA甲基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)量，結(jié)果表明，Dnmt1、Dnmt3b和Dnmt3L表達(dá)量均隨年齡增加而顯著下降（＜0.05），Dnmt3a表達(dá)量未隨年齡增加發(fā)生顯著變化（＞0.05），見圖1。

圖1 青年、老年鼠2細(xì)胞／4細(xì)胞胚胎Dnmts表達(dá)量Fig.1 Expression level of Dnmts in 2-4cell embryos of young or old mice

2.2 8細(xì)胞／桑椹胚中Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b、Dnmt3L在老化過程中表達(dá)量的顯變化

通過Western-blot方法測(cè)定青、老年小鼠8細(xì)胞／桑椹胚中4種主要DNA甲基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)量，結(jié)果表明，Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b和Dnmt3L表達(dá)量均未隨年齡增加發(fā)生顯著變化（＜0.05），見圖2。

圖2 青、老年鼠8細(xì)胞／桑椹胚胚胎Dnmts表達(dá)量Fig.2 Expression level of Dnmts in 8cell／morula embryos of young or old mice

2.3 囊胚中Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b、Dnmt3L在老化過程中表達(dá)量變化

通過Western-blot方法測(cè)定青、老年小鼠囊胚中4種主要DNA甲基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)量，結(jié)果表明，Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b和Dnmt3L表達(dá)量均未隨年齡增加發(fā)生顯著變化（＜0.05），見圖3。

圖3 青、老年鼠囊胚Dnmts表達(dá)量Fig.3 Expression level of Dnmts in blastocyst of young or old mice

3 討論

DNA甲基化與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、X-染色體失活、印記基因轉(zhuǎn)錄靜默及組織特異性基因表達(dá)等生物過程有關(guān)。小鼠胚胎DNA甲基化模式是通過Dnmt1蛋白的正確表達(dá)和階段特異性的翻譯來維持的。小鼠Dnmt1基因缺失，突變導(dǎo)致胚胎因基因組甲基化水平下降、甲基化模式紊亂，印記基因表達(dá)異常，最終導(dǎo)致胚胎異常發(fā)育或死亡，這是由于Dnmt1基因表達(dá)的缺失使基因的調(diào)節(jié)功能遭到破壞，進(jìn)而破壞了胚胎基因表達(dá)的時(shí)空特性。

胚胎發(fā)育早期，Dnmt3b和Dnmt3a基因特異表達(dá)時(shí)間不同：Dnmt3b基因特異在胚胎全能干細(xì)胞時(shí)期表達(dá)，以及內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的外胚層細(xì)胞中；而Dnmt3a基因在胚胎10.5日齡后廣泛表達(dá)于各種組織和細(xì)胞中。Dnmt3b基因缺失或突變引起的表型異常程度遠(yuǎn)高于Dnmt3a基因缺失或突變，這可能與兩者特異性表達(dá)時(shí)間不同有關(guān)。M.Okano等利用逆轉(zhuǎn)錄病毒分別感染Dnmt3a缺失胚胎干細(xì)胞、Dnmt3b缺失胚胎干細(xì)胞和兩種酶都缺失的胚胎干細(xì)胞，再通過甲基化敏感酶分析前病毒DNA的甲基化水平，從而反映胚胎干細(xì)胞的從頭甲基化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，只有Dnmt3a和Dnmt3b中一種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶缺失時(shí)，胚胎干細(xì)胞可使前病毒DNA新發(fā)甲基化，而兩種酶均缺失的胚胎干細(xì)胞則喪失了使前病毒DNA發(fā)生從頭甲基化的能力。在哺乳動(dòng)物早期胚胎中也有前述現(xiàn)象發(fā)生，說明胚胎干細(xì)胞和早期胚胎的從頭甲基化需要Dnmt3a、Dnmt3b的共同作用。Dnmt3L高度表達(dá)于睪丸和胎盤的絨毛膜，協(xié)同Dnmt3家族行使從頭甲基化功能。Y.Arakawa等的研究表明，Dnmt3a、Dnmt3b在保持胚胎干細(xì)胞和早期胚胎的印記甲基化模式中可能起一定的作用，但不起主要作用；猜測(cè)正常甲基化模式的建立需要Dnmt3家族和Dnmt1的共同作用。Dnmt1是Dnmt3家族啟動(dòng)的CpG核苷酸從頭甲基化的保證，而Dnmt3家族使甲基化水平提高到正常需要水平。

本試驗(yàn)中，2細(xì)胞和4細(xì)胞胚胎除Dnmt3a表達(dá)量無差異外，其余3種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（Dnmt1、Dnmt3b、Dnmt3L）表達(dá)量均隨年齡增加呈顯著下降趨勢(shì)（＜0.05）；在8細(xì)胞／桑椹胚和囊胚中以上4種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)量均無顯著差異（＞0.05）。另外本課題組的前期研究證明，老年鼠8細(xì)胞／桑椹胚和囊胚時(shí)期胚胎的DNA甲基化水平亦明顯低于青年鼠。說明老年鼠胚胎Dnmts表達(dá)量下降，導(dǎo)致DNA甲基化模式紊亂。胚胎從8細(xì)胞期開始，相關(guān)印記基因表達(dá)從母源性控制轉(zhuǎn)向胎源性自主調(diào)控，老年鼠2細(xì)胞和4細(xì)胞胚胎Dnmts表達(dá)量下降，導(dǎo)致胚胎無法啟動(dòng)正常的胎源性調(diào)控功能，這可能使Dnmts表達(dá)量異常的胚胎大量死亡，進(jìn)而表現(xiàn)為老年小鼠的妊娠率和平均產(chǎn)仔數(shù)均顯著低于青年小鼠，且老年小鼠產(chǎn)出的死胎和畸胎率明顯高于青年小鼠。

4 結(jié)論

小鼠老化導(dǎo)致2細(xì)胞和4細(xì)胞胚胎Dnmt1、Dnmt3b、Dnmt3L表達(dá)量顯著下降。