歐陽晨捷 周東華 劉小燕 陳瑩 平靜 葛娟 潘育

目前宮頸癌是嚴重威脅女性生命健康的第二大疾病，其中以宮頸鱗狀細胞癌為最常見的組織學類型。我國每年新增宮頸癌人數(shù)約9.89 萬，占世界宮頸癌總?cè)藬?shù)的17.4%，每年死亡的人數(shù)達到3.05萬，有發(fā)病率不斷上升及發(fā)病年齡日趨年輕化的跡象[1]。因此，提高宮頸癌的診治水平十分緊迫。人乳頭瘤病毒（HPV）已被證實是宮頸癌的首要致病因素[2]，從感染到進展為癌需要8～10年。對宮頸上皮內(nèi)病變（CIN）的患者早診斷、早治療以及系統(tǒng)隨訪是降低宮頸癌發(fā)病的關鍵。但不是所有感染高危型HPV的女性都會發(fā)生CIN或?qū)m頸癌，說明在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中，還有除了病毒以外的因素發(fā)揮致病作用。近年來，研究發(fā)現(xiàn)Cathepsin D參與了多種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[3，4]，是一類腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移相關的酶。但是，Cathepsin D在宮頸鱗癌中的表達情況鮮有報道。本研究旨在探討Cathepsin D在不同宮頸病變中的表達情況，分析其與高危型HPV感染的相關性。

1 材料與方法

1.1 一般資料 收集我院病理科2018年1月～2020年8月期間確診的40例子宮頸鱗狀細胞癌手術切除的患者組織標本（宮頸癌組）和58例CIN經(jīng)陰道鏡活檢、宮頸錐切及子宮全切術標本（CIN組）；同時選取同期因子宮肌瘤和（或）子宮腺肌癥行子宮全切術的住院患者，術前常規(guī)行宮頸液基細胞學檢查，未見異常，并通過病理證實為慢性宮頸炎（等同于本實驗的正常宮頸組織）標本28例（對照組）。其中CINⅠ21例，CINⅡ18例，CINⅢ19例?；颊吣挲g28～65歲，中位年齡45歲。所有患者在取材前都未做過任何特殊治療，也無特殊疾病史。

鼠抗人單克隆抗體Cathepsin D（D-7）:sc-377299購自美國SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY,INC。免疫組織化學Power Vision二步法試劑盒（PV-9 000）購自北京中杉金橋生物技術有限公司，二抗DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。Cobas 4800 HPV DNA檢測系統(tǒng)購自羅氏診斷公司。

1.2 免疫組織化學染色方法 組織切片經(jīng)常規(guī)脫蠟、脫水后，用0.01mol/L的枸櫞酸緩沖液高壓修復10min,冷卻到室溫后，PBS沖洗3次，每次3min；3% H2O2室溫孵育10min，PBS沖 洗3次，每 次5min；滴加稀釋濃度為1：50的Cathepsin D一抗后，按Power Vision二步法免疫組織化學試劑盒（PV-9000）的說明書進行操作，二抗孵育30min后，DAB顯色劑顯色，蘇木素復染，返藍，脫水，透明，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察。以Cathepsin D抗體試劑盒說明的涎腺組織作為陽性對照標本，同時采用PBS液取代一抗作為陰性對照標本。

1.3 高危型 HPV 檢測 基于實時熒光定量聚合酶鏈反應（PCR）技術的Cobas 4800 HPV DNA檢測系統(tǒng)可檢測14種HPV高危亞型，即HPV16型、18型和其他12種高危HPV亞型匯總的結(jié)果。

1.4 結(jié)果判定 Cathepsin D陽性表達主要為細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒，但要考慮到著色的強度及陽性細胞所占比例。本實驗建立了一個分值累加的系統(tǒng)：①按著色強度打分：無著色0分，淡黃色顆粒1分，棕黃色顆粒2分，棕褐色顆粒3分；②在目鏡視場數(shù)為22的200倍顯微鏡下，隨機看5個視野，取平均值，按陽性細胞所占比例打分：＜1%計為0分，1%～10%計為1分，10%＜陽性細胞數(shù)≤50%計為2分，50%＜陽性細胞數(shù)≤80%計為3分，＞80%計為4分。將①、②兩項分值相加為免疫組化最終評分，陰性：0～1分，陽性：2～7分。全部實驗對象的免疫組織化學染色切片由兩位病理醫(yī)師一致性雙盲觀察診斷。

1.5 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計學分析。組間率的比較采用χ2檢驗。兩組變量間的相關分析采用Spearman等級相關分析。檢驗采用雙側(cè)檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Cathepsin D在對照組、CIN 組和宮頸癌組中的表達 Cathepsin D在各組宮頸組織中的表達水平不同，在對照組、CIN 組、宮頸癌組中的陽性表達率分別為14.3%（4/28）、79.3%（46/58）、95.0%（38/40），各組間差異有統(tǒng)計學意義（χ2=55.518，P＜0.01）。宮頸病變逐漸加重，隨著Cathepsin D的陽性表達率逐漸升高，與宮頸病變程度呈正相關（r=0.608，P＜0.01）。見圖1～5。

圖1 Cathepsin D在正常子宮頸組織中的表達

圖2 Cathepsin D在CINⅠ中的表達

圖3 Cathepsin D在CINⅡ中的表達

圖4 Cathepsin D在CINⅢ中的表達

圖5 Cathepsin D在宮頸鱗癌中的表達

2.2 Cathepsin D在CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ組 內(nèi)的表達在CIN組內(nèi)，CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ中Cathepsin D的陽性表達率分別為61.9%（13/21）、83.3%（15/18）、94.7%（18/19），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=6.810，P＜0.05）。

2.3 Cathepsin D在正常對照組、CINⅠ組、CINⅡ組、CINⅢ組及宮頸癌組各組之間的比較 CIN組Cathepsin D陽性表達率高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（χ2= 32.807，P＜0.01），宮頸癌組Cathepsin D陽性表達率高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（χ2= 45.437，P＜0.05），宮頸癌組Cathepsin D陽性表達率高于CIN組，差異有統(tǒng)計學意義（χ2= 4.759，P＜0.05）。CINⅠ組和CINⅡ組（χ2= 2.198，P＞0.05）、CINⅡ組和CINⅢ組（χ2= 1.247，P＞0.05）以及CINⅢ組和宮頸癌組（χ2= 0.002，P＞0.05）之間差異無統(tǒng)計學意義，而在CINⅠ組和CINⅢ組之間差異有統(tǒng)計學意義（χ2= 6.166，P＜0.05）。

2.4 Cathepsin D和高危型HPV在宮頸病變組織中的相關性分析 通過Spearman等級相關分析提示，在不同程度宮頸病變中，Cathepsin D的表達與高危型HPV的感染呈正相關（P＜0.05）。見表1。

表1 Cathepsin D和高危型HPV的相關性分析（n）

3 討論

宮頸鱗癌的發(fā)病是一個從組織非典型增生到原位癌再到浸潤癌循序漸進的過程。發(fā)現(xiàn)高危型HPV病毒與宮頸癌發(fā)生有直接關系。在細胞惡性轉(zhuǎn)化過程中，E6、E7基因過度表達讓病毒基因整合，使宿主細胞的腫瘤抑制蛋白P53、Rb失活[5]。無疑持續(xù)的高危型HPV感染是導致CIN及宮頸癌的首要因素。但感染高危型HPV并不完全造成必然發(fā)生宮頸癌，還需要其他方法的適當介入來提高宮頸癌篩查的準確率。近年來，研究者們發(fā)現(xiàn)Cathepsins（組織蛋白酶）作為人體中重要的信號分子，有序地調(diào)節(jié)著人體的生命過程；一旦失調(diào)，會導致腫瘤的發(fā)生。根據(jù)氨基酸活化部位的不同，Cathepsins家族有11個成員，分布于各種哺乳動物組織的細胞溶酶體內(nèi)，是一組強效的溶酶體水解酶，與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移相關[6]。Cathepsin D是Cathepsins家族中的一員，是一種天冬氨酸溶酶體蛋白水解酶。在腫瘤的酸性微環(huán)境中，Cathepsin D的高表達可作為一種絲裂原會引起有絲分裂時，有絲分裂原底物的調(diào)控失常，引起細胞分化的缺乏，并且刺激細胞不斷迅速分裂、生長，引起克隆性無限增殖[7]。本研究發(fā)現(xiàn)Cathepsin D在CIN和宮頸癌組織中的陽性表達率均高于正常宮頸組織（P＜0.05），在宮頸癌組織的陽性表達率高于CIN組織（P＜0.05），在CINⅢ組織的陽性表達率高于CINⅠ組織（P＜0.05），Cathepsin D的陽性表達率與宮頸病變程度呈正相關（r=0.608，P＜0.05），符合宮頸鱗癌的進展過程，可提示Cathepsin D的表達上調(diào)促進了宮頸鱗癌的發(fā)生與發(fā)展。Cathepsin D一方面通過水解作用使細胞外基質(zhì)降解，讓腫瘤細胞順利快速轉(zhuǎn)移；另一方面通過使Cathepsin B、尿激酶原激活因子激活，并與尿激酶原激活因子受體結(jié)合，參與與腫瘤相關的分解作用[8]。Cathepsin D的過度表達還可激活溶酶體靶通道，讓Cathepsin D蛋白酶原及其它溶酶體酶不斷分泌和釋放[9]，促進了周圍局部溶解區(qū)域的形成，為腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移提供了通道，進而激發(fā)了腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移的潛能。通過Spearman等級相關分析，在不同程度宮頸病變中，Cathepsin D的表達與高危型HPV的感染呈正相關（r=0.242，P=0.006），提示Cathepsin D表達上調(diào)和高危型HPV感染在宮頸癌的發(fā)病機制中可能起著協(xié)同作用。

綜上所述，Cathepsin D在子宮頸鱗狀細胞癌發(fā)生發(fā)展過程中表達逐漸升高，說明Cathepsin D在宮頸癌的發(fā)病機制中起到了一定的促進作用，可能參與宮頸鱗癌的侵襲轉(zhuǎn)移過程。Cathepsin D的高表達和高危型HPV的感染在宮頸病變的發(fā)生發(fā)展過程中有著密切的聯(lián)系，兩者在宮頸癌的發(fā)病機制中可能起著協(xié)同作用，為宮頸癌發(fā)病機制和治療的研究提供了新思路，但這一推測需要后續(xù)的實驗研究進一步驗證。